重組百日咳DNA疫苗實驗研究.pdf

1、本文將第二代疫苗技術和第三代疫苗技術相結合，以基因工程方法研究重組百日咳DNA疫苗的免疫效果。首先，選取百日咳鮑特菌的免疫保護性抗原百日咳毒素S1亞基PTS1、粘著素PRN和絲狀血凝素FHA的基因片段。用基因工程的方法，先將PTS1的9位和129位氨基酸進行定點誘變，再將PTS1、PRN、FHA基因片段相連接，得到融合DNA片段PTS1-PRN-FHA(PPF)。將該融合片段重組到真核表達載體pVAX1中，同時將PTS1、PRN、FHA

2、各片段分別重組到真核表達載體pVAX1中。以融合質粒(融合組)和混合的三種質粒(混合組)免疫小鼠，檢測發(fā)現(xiàn)融合組和混合組均誘導小鼠產(chǎn)生特異性抗體抗PTS1、抗PRN、抗：FHA，并同時產(chǎn)生細胞因子IL-10、IL-4、IFNγ和TNF-α，顯示融合質粒與混合質粒一樣，能誘導小鼠的體液和細胞免疫反應。本研究應用以下三種方法，探討改善重組百日咳疫苗免疫效應的策略。一，在初次免疫時合并注射重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子GM-CSF質粒；二，初

3、次免疫時合并注射重組GM-CSF質粒，并以原核表達的重組百日咳抗原片段蛋白進行加強免疫；三，將重組的百日咳抗原片段基因引入腺病毒載體，探討其免疫效應。 首次將GM-CSF質粒用于重組百日咳DNA疫苗研究。結果顯示，與單純DNA質粒組相比，合并注射GM-CSF質粒的小鼠誘導產(chǎn)生更多的抗PTS1、IL-4和TNF-α，說明在初次免疫的時候合并免疫GM-CSF質粒能增強實驗小鼠的細胞和體液免疫反應。在用致死量的百日咳鮑特菌進行腦腔攻擊

4、的實驗中，單純DNA質粒組、合并GM-CSF質粒組對致死量腦腔百日咳鮑特菌攻擊均有一定的保護作用，但兩組的保護率沒有顯著性差異。 首次提出以GM-CSF質粒合并DNA疫苗進行初次免疫，并以DNA疫苗相應的重組蛋白進行加強免疫的策略。結果顯示，與單純DNA疫苗組比較，初次免疫時無論有無GM-CSF質粒參與，重組蛋白加強免疫的實驗組小鼠均誘導產(chǎn)生顯著增多的抗PTS1、抗PRN、抗FHA抗體，這說明以重組蛋白加強免疫能夠極顯著增強．D

5、NA疫苗誘導的體液免疫反應。而與單純DNA疫苗組相比，合并GM-CSF質粒初次免疫、重組蛋白加強免疫組小鼠誘導產(chǎn)生的抗PTS1、抗PRN、抗FHA、IL-10、IL-4、IFN-γ和TNF-α均顯著增多。在特異性脾細胞增殖實驗中，GM-CSF質粒初次免疫、重組蛋白加強免疫組小鼠還誘導產(chǎn)生了更強的脾細胞特異性增殖反應。這顯示與單純合并GM-CSF質粒初次免疫以及DNA初次免疫、重組蛋白加強免疫策略相比，合并GM-CSF質粒初次免疫、重組蛋

6、白加強免疫的策略能誘導實驗小鼠產(chǎn)生更強的體液和細胞免疫反應，合并細胞因子初次免疫并以重組蛋白進行加強免疫是改善DNA疫苗免疫反應的有效策略，值得進一步的研究和優(yōu)化。 試圖將重組百日咳抗原片段導入腺病毒載體。以病毒作為載體的疫苗有其自身的優(yōu)越性，可能產(chǎn)生更高的蛋白表達水平，進而誘導更強的免疫反應。試圖通過穿梭質粒pShuttleCMV將百日咳抗原片段融合基因重組入腺病毒載體，在AD293細胞組裝后感染動物，探討其誘導的保護性免疫反

7、應。本部分基于腺病毒載體的重組百日咳疫苗正在研究之中。盡管百日咳疫苗已經(jīng)應用了近一個世紀，但百日咳引起的健康和經(jīng)濟問題并未解決，甚至有更加嚴重的趨勢。DNA疫苗已在多種感染性病原體和多種動物模型中證實能誘導體液和細胞免疫反應，本研究證明DNA疫苗也可能成為應對百日咳的候選疫苗。 DNA疫苗目前存在的問題是在大動物誘導產(chǎn)生的免疫反應強度和對機體的保護作用有限，增強DNA疫苗免疫反應的各種策略是當前研究的熱點課題，本研究提出的增強D