心肌營養(yǎng)素-1誘導小鼠誘導性多能干細胞心肌細胞定向分化的實驗研究.pdf

1、背景：
　　2006年Takahashi等采用逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)向小鼠的成纖維細胞導入4個轉(zhuǎn)錄因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc),成功將其重新編程為誘導性多能干細胞(iPSCs),這一發(fā)現(xiàn)引起了人們的極大興趣和關注并獲得2012年諾貝爾醫(yī)學生理學獎。由于iPSCs具有與胚胎干細胞(ESCs)類似的自我更新和多向分化的特性,同時又避免了ES細胞的免疫排斥、倫理學爭議等焦點問題,因此很快成為了干細胞領域的研究熱點。隨后,

2、大量研究證實iPSC可分化成為包括心肌細胞在內(nèi)的所有三胚層來源的細胞類型,這使得用iPSC進行心肌損傷性疾病的細胞治療成為可能。然而,誘導iPSCs向心肌細胞定向分化的高效方法,仍然是困擾心肌再生研究的一大瓶頸問題。心肌營養(yǎng)素-1(CT-1)作為在小鼠胚胎心臟發(fā)生過程中高表達的轉(zhuǎn)錄因子,已被證實對胚胎干細胞(ESCs)和骨髓間充質(zhì)干細胞(BMMSCs)等多種類型的干細胞的心肌細胞定向分化具有促進作用。然而,目前尚未見有關CT-1對iPS

3、C誘導作用的報道。
　　目的：
　　本實驗采用CT-1對小鼠誘導性多能干細胞(miPSCs)進行誘導,觀察其對心肌細胞定向分化的作用。
　　方法：
　　(1)小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)的原代分離、培養(yǎng)以及飼養(yǎng)層細胞的制備;
　　(2)iPSC的培養(yǎng)(復蘇、傳代、凍存);
　　(3)免疫熒光染色鑒定小鼠iPSC多能性標志物Oct-4;
　　(4)懸滴三步法誘導制備擬胚體(EBs),使用含或不含C

4、T-1的誘導分化培養(yǎng)基進行干預;
　　(5)RealtimePCR檢測不同誘導時間點擬胚體中心肌特異性標志物的基因表達水平;
　　(6)采用免疫熒光染色及流式細胞術檢測對照組與CT-1組間心肌特異性分化標志物肌鈣蛋白I(cTnI)的表達變化差異;
　　(7)采用透射電鏡觀察對照組與CT-1組間心肌樣細胞(iPS-CM)的超微結(jié)構變化。
　　結(jié)果：
　　(1)miPSC在倒置顯微鏡下觀察呈圓形或橢圓形克隆,邊

5、界透亮、清晰、立體感強。多能性干細胞標志物Oct-4免疫熒光染色后呈陽性;
　　(2)實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,CT-1組中心臟中胚層標志物flk-1基因第7、第10天的表達水平,分別為同期對照組的(1.61±0.03)倍和(2.01±0.01)倍(P<0.05);心臟祖細胞標志物Nkx2.5基因第7、第10、第14天的表達水平,分別為同期對照組的(2.08±0.08)倍、(2.12±0.15)倍和(1.99±0.06)倍(P<

6、0.01);心臟發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子Tbx5基因第7、第10天的表達水平,分別為同期對照組的(1.61±0.05)倍和(1.86±0.04)倍(P<0.05)。心肌特異性標志物cTnT基因第10、第14天的表達水平,分別為同期對照組的(1.75±0.04)倍和(1.78±0.05)倍(P<0.05),說明CT-1可顯著提高EB中心臟發(fā)生過程中各階段特異性標志物基因表達的水平。
　　(3)免疫熒光染色法檢測結(jié)果顯示,兩組均有cTnI表達

7、。流式細胞術鑒定結(jié)果顯示,對照組與CT-1組cTnI的陽性率分別為(28.5±4.2)％和(56.4±6.6)%,有顯著性差異(P<0.05)。
　　(4)透射電鏡結(jié)果顯示,CT-1組肌原纖維及胞內(nèi)線粒體明顯增多,肌纖維排列規(guī)則,可見細胞間橋粒連接和縫隙連接。
　　結(jié)論：
　　本實驗研究結(jié)果表明,CT-1可通過上調(diào)心臟中胚層標志物Flk-1和心臟祖細胞標志物Nkx2.5、Tbx5的表達,顯著提高miPSC向心肌細胞定向