PITX1基因在骨肉瘤中的表達及其調(diào)控機制的研究.pdf

1、骨肉瘤是高度惡性的原發(fā)骨腫瘤，多見于兒童、青少年，臨床治療難度大，治愈率低。目前通常采取手術(shù)，放、化療等為主的綜合治療手段，盡管應(yīng)用新輔助化療法明顯提高了患者生存率，但近30年來，骨肉瘤的治療方面的進展較為緩慢。據(jù)統(tǒng)計，骨肉瘤的5年生存率及總生存率均在60％左右，即使是運用了聯(lián)合治療手段，仍有大約40％患者最終死于骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移。另外，化療毒副反應(yīng)嚴(yán)重，耐藥性的出現(xiàn)也使現(xiàn)有化療手段陷入困境。骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制至今仍然沒有得到很好

2、的闡明。因此，對骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制進行深入研究，尋找特異性基因治療靶點，將有助于我們更早、更準(zhǔn)確的診斷，以及開發(fā)新的、安全有效的理想治療方案。
　　PITX1（paired-like homeodomain trancription factor1，PITX1）基因在人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，并逐步被證實為抑癌基因。PITX1作為抑癌基因參與腫瘤調(diào)節(jié)過程是通過抑制PITX1的表達，誘導(dǎo)人原始細胞的致癌信號

3、，從而激活Ras，促使細胞無限增殖，導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Liu DX等人進一步確證了PITX1作為一抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。并指出，PITX1是P53的上游轉(zhuǎn)錄因子，通過P53影響乳腺癌的發(fā)展。但PITX1在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用及機制國內(nèi)外仍未見報道。本研究擬檢測PITX1基因在骨肉瘤中的表達情況，并初步探討其臨床意義及調(diào)控分子機制，為骨肉瘤的早期診斷及尋找新的、更為有效的治療方法提供理論依據(jù)

4、。
　　方法：
　　第一部分：PITX1在骨肉瘤組織中的表達及臨床意義
　　1.收集骨肉瘤及正常骨組織蠟塊標(biāo)本，制成石蠟切片。
　　2.免疫組織學(xué)分析，檢測PITX1蛋白在正常骨組織及骨肉瘤組織中的表達情況。
　　3.收集相應(yīng)骨肉瘤患者臨床信息資料，并按一定標(biāo)準(zhǔn)分組。
　　4.實驗數(shù)據(jù)分析和處理。用GraphPad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，測得數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計量資料的

5、組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，率的比較采用Chi—Square檢驗，生存分析采用Kaplan—Meire法與COX比例風(fēng)險模型進行統(tǒng)計分析。
　　第二部分：PITX1對U2OS細胞株的影響
　　1.細胞培養(yǎng)：骨肉瘤細胞株U2OS用DMEM/F121:1（含10%胎牛血清），在37℃5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。
　　2.以Lipofectamine2000為載體，將設(shè)計合成的PITX1-siRNA轉(zhuǎn)染U2OS細胞

6、株。按轉(zhuǎn)染的不同分不同實驗對照組。
　　3. Real-Time PCR檢測U2OS細胞中各處理組PITX1、RASAL1、P53mRNA的表達情況。
　　4.蛋白免疫印跡法檢測U2OS細胞中各處理組PITX1、RASAL1、P53蛋白的表達情況。
　　5. MTT法檢測PITX1-siRNA對U2OS細胞增殖的影響。
　　6.流式細胞術(shù)檢測PITX1-siRNA對U2OS細胞凋亡的影響。
　　7. Tra

7、nswell小室法檢測PITX1-siRNA對U2OS細胞遷移、侵襲能力的影響。
　　8.實驗數(shù)據(jù)分析和處理。用GraphPad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)使用單因素方差分析的Newman-Keul's檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　第一部分：PITX1在骨肉瘤組織中的表達及臨床意義
　　1．PITX1在骨肉瘤組織的表達顯著低于正常骨組織。
　　2．PITX1與骨肉瘤患者的生存期、肺轉(zhuǎn)移

8、密切相關(guān)。
　　3．PITX1高表達為骨肉瘤患者預(yù)后的有利因素。
　　第二部分：抑制PITX1對U2OS細胞株的影響
　　1．U2OS細胞中，抑制PITX1基因后，下游基因RASAL1、P53mRNA及蛋白的表達出現(xiàn)相應(yīng)的下調(diào)。
　　2．U2OS細胞中，抑制PITX1基因后，細胞的侵襲、遷移、增殖能力增強，而凋亡率降低。
　　結(jié)論：
　　PITX1在骨肉瘤組織的表達顯著低于正常骨組織；PITX1表達的