普通型胃腺癌中神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞克隆性起源的研究.pdf

1、普通型胃腺癌伴神經(jīng)內(nèi)分泌(neuroendocrine，NE)分化，是指胃腺癌中有分化的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，但其數(shù)目在癌組織成分中所占的比例較小不足50％，且以單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞巢的形式分散存在，是彌漫神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的一部分。我們以往研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌伴散在NE細(xì)胞分化約占38.1％，大腸癌和乳腺癌分別為41.5％和21％，且高分化癌NE細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)率明顯高于低分化癌。而普通型胃腺癌中，NE細(xì)胞分化約占39.6％，低分化腺癌明顯高于高分化腺癌。這些

2、差異是否與腫瘤所在部位的胚胎起源、腫瘤病因?qū)W、組織發(fā)生學(xué)的不同及遺傳學(xué)改變有關(guān)，仍處于探索研究階段。 與神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤相比，非神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中NE細(xì)胞研究較少，特別是用分子遺傳學(xué)方法研究普通型胃腺癌中單個(gè)NE細(xì)胞的起源方面尚未見(jiàn)報(bào)道。關(guān)于普通腺癌伴NE分化的發(fā)生機(jī)制存在許多不同的假說(shuō)。目前多數(shù)人認(rèn)為NE細(xì)胞和上皮細(xì)胞均來(lái)源于內(nèi)胚層多潛能干細(xì)胞。在腫瘤發(fā)生及演進(jìn)過(guò)程中，內(nèi)胚層的多能干細(xì)胞受激素、局部微環(huán)境及基因組不穩(wěn)定性的影響，使

3、某些被抑制的基因組密碼發(fā)生隨機(jī)脫抑制，在RNA翻譯水平選擇性的激活兩種以上的調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生雙向或多向分化。然而，這些推測(cè)僅建立在形態(tài)學(xué)的觀察及體外實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，缺乏可靠性和再現(xiàn)性；且不同腫瘤組織中散在的NE細(xì)胞不論在形態(tài)上還是對(duì)腫瘤組織的生物學(xué)行為的影響上都存在很大區(qū)別，究竟散在的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞是否存在染色體及相關(guān)基因水平的改變，它們是否為腫瘤的一種成分，尚不清楚。因此，我們對(duì)伴神經(jīng)內(nèi)分泌分化的普通型胃腺癌進(jìn)行分子水平的研究，以期明確NE

4、細(xì)胞的克隆性起源，對(duì)這一類(lèi)型的胃腸道腫瘤做出新的評(píng)價(jià)。 激光顯微切割技術(shù)的出現(xiàn)，使得我們能夠從胃腺癌中獲取單個(gè)散在的NE細(xì)胞。全基因組擴(kuò)增技術(shù)是一項(xiàng)以微量(ng級(jí))DNA為模板，通過(guò)Phi29DNA聚合酶強(qiáng)大的結(jié)合能力及3’-5’外切酶活性對(duì)全基因組進(jìn)行高保真性地連續(xù)擴(kuò)增，從而得到大量(μg級(jí))基因組DNA的新技術(shù)，它彌補(bǔ)了模板量不足的問(wèn)題。聯(lián)合激光顯微切割及全基因組放大，獲取腺癌中NE細(xì)胞，提取DNA并與腺癌細(xì)胞進(jìn)行分子水平改

5、變的比較，在全基因組范圍內(nèi)尋找復(fù)制差異片段，推測(cè)其克隆起源。 干細(xì)胞在分化過(guò)程中，染色體有絲分裂不均衡，可造成部分基因在兩種分化的細(xì)胞中同時(shí)出現(xiàn)等位基因的改變(增益、丟失或突變)，此原理可以通過(guò)微衛(wèi)星改變(包括微衛(wèi)星不穩(wěn)定和雜合性丟失)及突變、CGH等方法推斷組織細(xì)胞的克隆性起源。微衛(wèi)星不穩(wěn)定及雜合性丟失已成為較成熟的推斷腫瘤起源的方法，它具有敏感性強(qiáng)的特點(diǎn)，但由于各實(shí)驗(yàn)室選擇微衛(wèi)星位點(diǎn)的差異較大，尚缺乏特異性。基因的突變同樣可

6、以推測(cè)腫瘤起源，具有較高的特異性但敏感性不強(qiáng)。聯(lián)合微衛(wèi)星和突變的檢測(cè)可以使推理結(jié)果更準(zhǔn)確。 材料和方法本實(shí)驗(yàn)收集浙江省人民醫(yī)院2001-2003年間125例普通型胃腺癌及癌周正常胃粘膜新鮮標(biāo)本。首先利用冰凍切片-嗜鉻粒蛋白A(ChromograninA，CgA)單克隆抗體免疫組化篩選含NE細(xì)胞較多的胃腺癌組織及相應(yīng)正常對(duì)照組織，然后經(jīng)激光顯微切割獲取200個(gè)左右單個(gè)NE細(xì)胞、100個(gè)左右腺癌癌巢及正常腺體，切割后樣本采用DNAM

7、icro-kit抽提試劑盒及Repli-g擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行抽提和全基因組放大，其次在全基因組范圍內(nèi)選取39個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行PCR-SSLP分析及通過(guò)PCR-測(cè)序檢測(cè)p53突變發(fā)生情況，最后比較胃腺癌內(nèi)散在的NE細(xì)胞與腺癌細(xì)胞微衛(wèi)星改變和p53突變的一致性情況，推測(cè)NE細(xì)胞的克隆起源。 結(jié)果1.免疫組化-激光顯微切割結(jié)果：在125例胃腺癌中，中-大量NE細(xì)胞占28.8％(36/125)；在對(duì)應(yīng)病例的正常對(duì)照胃粘膜中占29.8％(39

8、/121)。其中，胃腺癌及正常胃粘膜中均有中-大量NE細(xì)胞的有14例，占11.2％。6例NE細(xì)胞含量最多而進(jìn)行激光顯微切割，在150倍物鏡下捕獲腺癌及正常腺體中單個(gè)NE細(xì)胞各200個(gè)左右，20倍物鏡下捕獲無(wú)NE細(xì)胞的腺癌癌巢組織及正常腺體100個(gè)左右。 2.微衛(wèi)星分析結(jié)果：從微衛(wèi)星改變上看，各樣本MSI發(fā)生率高于LOH。從不同細(xì)胞微衛(wèi)星改變發(fā)生率上比較，腺癌細(xì)胞高于NE細(xì)胞。從各位點(diǎn)所在染色體上看，LOH多發(fā)生于4q、5q、11

9、p、17p，位點(diǎn)附近為胃腸道常見(jiàn)腫瘤相關(guān)基因，而MSI多發(fā)生于7p、8p、12q、13q、18q。從兩種細(xì)胞LOH及MSI一致性上看，例6LOH在NE細(xì)胞及腺癌細(xì)胞中一致性最高，不一致性最低。例5MSI在NE細(xì)胞及腺癌細(xì)胞中一致性最高，不一致性最低。例2未發(fā)生一致性LOH而不一致改變的位點(diǎn)較多。各樣本LOH及MSI改變一致性程度從高到低為：例6＞例5＞例4＞例3＞例1＞例2。 3.p53基因外顯子5-8突變結(jié)果：6例樣本中，胃腺

10、癌細(xì)胞外顯子7、外顯子8及內(nèi)含子7各有1例發(fā)生突變，突變頻率為50％，而6例樣本中NE細(xì)胞各1例發(fā)生外顯子7及內(nèi)含子7突變，突變頻率為33.3％。序列分析結(jié)果顯示，外顯子7為第244位密碼子突變，內(nèi)含子7為23222位點(diǎn)突變，而外顯子8為第273位密碼子突變。外顯子7及內(nèi)含子7在兩例樣本(例4、例5)的腺癌細(xì)胞及NE細(xì)胞中均發(fā)生一致位點(diǎn)及類(lèi)型的突變，這些患者臨床病理組織學(xué)類(lèi)型均為低分化癌，TNM分期為ⅢA期。外顯子8僅在一例樣本(例1)