樹(shù)鼩和人載脂蛋白A5基因的克隆表達(dá)和載脂蛋白A5以及載脂蛋白C3基因多態(tài)性研究.pdf

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文樹(shù)鼩和人載脂蛋白A5基因的克隆表達(dá)和載脂蛋白A5以及載脂蛋白C3基因多態(tài)性研究姓名：李國(guó)平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：陳保生20040601中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士學(xué)位論文引入＆oRj酶消化位點(diǎn)，設(shè)計(jì)下游引物引入皿DI酶消化位點(diǎn)，擴(kuò)增后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行＆DRJ、j確oI雙酶消化，純化回收后與做同樣處理的原核表達(dá)載體pET30a連接。樹(shù)鼢APOA5在原核細(xì)胞中以融合形式高效表

2、達(dá)，蛋白表達(dá)量約為總蛋白量的346％。利用pET30a載體上Histag標(biāo)簽，樹(shù)銅APOA5可以通過(guò)鎳離子螯合樹(shù)脂進(jìn)行純化，純度可達(dá)80％以上，每升培養(yǎng)物可獲得純化蛋白13毫克。樹(shù)嘲APOA5基因成功的克隆表達(dá)，有利于進(jìn)一步研究它的結(jié)構(gòu)和功能。為了比較樹(shù)懿和人APOA5基因的結(jié)構(gòu)與功能，同時(shí)克隆和表達(dá)了人載脂蛋白A5，并制備了抗人ApoA5多克隆抗體。人載脂蛋白A5的克隆、表達(dá)和純化的大致步驟如下：首先從人肝組織中提取總RNA，經(jīng)純化得

3、到mRNA，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA第一鏈。為了下一步克隆，在上游引入NdeI酶消化位點(diǎn)，下游引入XhoI酶消化位點(diǎn)，以cDNA第一鏈為模板成功擴(kuò)增了成熟APOA5基因的eDNA序列。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)雙酶消化后被精確連入原核表達(dá)載體pET30b。APOA5以包涵體的形式在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表達(dá)，目的蛋白表達(dá)量約為菌體蛋白表達(dá)總量的289％。利用pET30b載體上Histag標(biāo)簽，APOA5可通過(guò)鎳離子螯合樹(shù)脂進(jìn)行純化，純化后純