STAT3反義寡核苷酸治療實驗性結腸炎的研究.pdf

1、研究目的和背景 克羅恩病(CD)的病因尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，CD發(fā)病時，腸粘膜免疫功能異常，炎癥腸粘膜固有層單個核細胞(LPMC)異常激活、激活的LPMC對激活后細胞凋亡(AICD)抵抗，導致炎癥持續(xù)。炎癥腸粘膜有大量的炎癥細胞因子產(chǎn)生，如TNF-α、INF-γ、IL-6、IL-2等，這些細胞因子能激活炎癥細胞內的炎癥信號分子，如NF-κB和STAT等，這些信號分子在細胞核內與炎癥分子基因的啟動子結合，調節(jié)炎癥分子的表達。抑制上述

2、炎癥分子機制的正反饋，對相關疾病具有一定的治療作用。最近臨床研究發(fā)現(xiàn)，作為IL-6的炎癥細胞內信號分子STAT3，可能參與了CD的發(fā)病機制。 CD發(fā)病時，腸粘膜T細胞異常激活，這些激活的T細胞對AICD存在抵抗。T細胞抵抗AICD與IL-6有關，使用針對IL-6受體的抗體，在細胞外阻斷IL-6與IL-6受體結合，能誘導炎癥腸粘膜T細胞發(fā)生凋亡，最近臨床研究證實，該抗體對CD可能有一定的治療效果。STAT3是IL-6炎癥細胞內的信

3、號分子，研究發(fā)現(xiàn)，CD患者腸粘膜LPMC表達STAT3增高，并有大量STAT3激活，激活的STAT3可能參與了T細胞抵抗AICD的機制。然而有學者認為，STAT3分子在有的免疫細胞內存在一定的抗炎作用。例如，單核細胞內STAT3基因敲除的小鼠呈現(xiàn)對IL-10低反應性，說明單核細胞內STAT3能被IL-10激活。因此，STAT3蛋白在CD發(fā)病中的作用需要進一步研究。 本實驗中，我們在與CD免疫反應類型及病理組織學十分類似的小鼠TN

4、BS結腸炎早期，用STAT3反義寡核苷酸(ASON)灌腸，以抑制STAT3的表達和激活，研究STAT3參與該結腸炎發(fā)病可能的機制，及抑制STAT3表達是否對結腸炎具有治療作用。 實驗方法 在實驗第1天，用0.1ml含2.0mgTNBS的50％乙醇溶液灌腸，用體重約22g的BALB/c小鼠造TNBS結腸炎模型，對照組小鼠僅用0.1ml50％乙醇灌腸。實驗第3天，用15nmolSTAT3ASON或錯配反義寡核苷酸(MMAS)

5、灌腸治療。每天記錄小鼠體重。 實驗第7天處死小鼠，分離炎癥最明顯處的結腸組織，用4％甲醛固定，HE染色，顯微鏡下觀察組織學形態(tài)。 自新鮮的結腸組織中分離出LPMC，經(jīng)annexinV和PI染色后，流式細胞儀檢測LPMC的細胞凋亡，用存活的LPMC百分比來反映LPMC的凋亡情況。提取LPMC細胞總蛋白，Westernblot檢測STAT3、磷酸化STAT3(pSTAT3)、及細胞凋亡相關蛋白bcl-2、bax等。

6、分別用免疫熒光、Westernblot等方法檢測每組小鼠結腸炎癥組織STAT3、pSTAT3的表達。用PBS對結腸組織進行勻漿，分別檢測TNF-α、INF-γ的濃度和組織MPO活性。 結論 LPMC內STAT3的激活參與了TNBS結腸炎的發(fā)病機制：調節(jié)炎癥細胞因子的表達，誘導LPMC對AICD抵抗。用STAT3ASON灌腸早期治療TNBS結腸炎，能減少炎癥細胞因子的分泌，誘導激活的LPMC凋亡。抑制LPMC的STAT3信