水牛體外成熟卵母細胞iTRAQ定量蛋白質組及其質量控制方法的研究.pdf

1、作為一種高度特化的雌性生殖細胞，哺乳類動物卵母細胞是動物個體發(fā)生的主體細胞。大量研究表明，卵母細胞的成熟質量與其受精后胚胎發(fā)育能力直接相關，同時體外成熟的卵母細胞是體外受精、體外胚胎生產、胚胎移植等一系列胚胎生產技術研究的基礎。然而，與體內成熟相比，目前大家畜卵母細胞體外成熟效率、囊胚發(fā)育率、母體受孕率均較低。這與卵母細胞核質成熟不同步、細胞質成熟不充分、體外成熟體系不完善有關，同時有關大家畜卵母細胞成熟分子機制尚不完全清楚也是關鍵因素

2、之一。卵子在生長和成熟過程中逐步獲得成熟、受精和胚胎發(fā)育的能力，這些能力的獲得與蛋白質合成、修飾、降解和聚積密切相關。因此，應用蛋白質組學技術研究卵母細胞成熟過程中蛋白質合成代謝變化規(guī)律將有望進一步揭示卵母細胞成熟的分子機制，對提高卵母細胞體外成熟質量具有重要意義。
　　本研究以具有地方特色的廣西本地水牛為對象，應用iTRAQ定量蛋白質組學技術對體外成熟前后、胞質正常與異常的水牛卵母細胞進行蛋白質組學研究。構建成熟前、后水牛卵母細

3、胞蛋白質組表達譜，鑒定體外成熟前后卵母細胞表達差異蛋白。通過生物學信息學分析，研究差異蛋白在水牛卵子成熟過程中的功能及參與的生物學途徑，以確定與水牛卵母細胞成熟相關的重要蛋白，并揭示水牛卵母細胞體外成熟的分子機制。
　　首先，應用一維凝膠電泳結合LC-MS/MS技術構建成熟前、后水牛卵母細胞蛋白質組表達譜。分別從體外成熟前、后的水牛卵母細胞中鑒定到647和570(FDR＜1％)種蛋白質，其中相同鑒定蛋白414種，占總鑒定蛋白的51

4、.6％。成熟前后的水牛卵子中均有9種高豐度表達蛋白質，其中8種為相同鑒定蛋白，包括穹窿體蛋白、谷胱甘肽S-轉移酶M3、醛糖還原酶、過氧化物還原酶2、二磷酸核苷酸激酶B、動力蛋白輕鏈1、蛋白精氨酸脫亞氨酶6、類甘油醛-3-三磷酸脫氫酶同源物2。對成熟前、后卵母細胞相同、特有鑒定蛋白的生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，相同鑒定蛋白在包括丙酮酸鹽代謝、糖酵解/糖原生成、TCA循環(huán)、結氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的降解、丙酸代謝、脂肪酸代謝和磷酸戊糖途徑等23條K

5、EGG信號通路顯著相關(p＜0.05)。表明能量代謝途徑在水牛卵母細胞成熟過程中發(fā)揮重要作用，它們?yōu)槁涯讣毎某墒焯峁┠芰縼碓?、保證卵母細胞減數分裂的完成。成熟前卵子特有鑒定蛋白與氧化磷酸化、核糖體、蛋白酶體等信號通路顯著相關(p＜0.05);成熟后卵子特有鑒定蛋白與DNA復制、氨基糖和核苷酸糖代謝信號通路顯著相關(p＜0.05)。結果還同時表明一些蛋白貫穿整個卵子成熟過程，并發(fā)揮重要作用。此外，卵母細胞在不同的發(fā)育時期特異表達一些蛋白

6、，參與維持其必需的生長和發(fā)育。
　　其次，應用iTRAQ定量蛋白質組學技術對成熟前、后和胞質正常與異常的水牛卵母細胞進行了研究。從成熟前后及胞質正常與異常的水牛卵母細胞共鑒定到3857(FDR＜1％)種蛋白質，可定量蛋白數3245種。進一步分析顯示，兩肽段以上鑒定蛋白數達到3287種，占總鑒定蛋白的85％。與已報道的牛卵母細胞蛋白質組數據集（占總鑒定量的34％-88％）相近。胞質正常MⅡ期卵子和GⅤ期卵子比較篩選出173種差異表達

7、蛋白，其中上調表達108種，下調表達65種。胞質正常與胞質異常的MⅡ期水牛卵子比較篩選出146種差異表達蛋白，其中111種上調表達，35種下調表達。胞質正常MⅡ期卵子和GⅤ期卵子的差異表達蛋白GO分析顯示，上調蛋白主要參與基于微管過程、蛋白質轉運、能量產生和物質代謝及細胞周期等生物學進程。胞質正常MⅡ期卵子與胞質異常MⅡ期卵子比較的差異表達蛋白GO分析顯示，上調蛋白主要參與氧化還原、翻譯、蛋白質轉運、氧化磷酸化及小G蛋白信號轉導途徑等生

8、物學進程。相較于GⅤ期細胞和胞質異常MⅡ期卵母細胞，氧化磷酸化信號通路中參與電子轉運呼吸鏈的關鍵酶在胞質正常MⅡ期細胞中表達均顯著上調。表明氧化磷酸化水平顯著影響水牛卵子的成熟質量，是卵子減數分裂和發(fā)育能力的重要過程;表明卵母細胞減數分裂成熟過程需要大量的能量供給，提示MⅡ期卵母細胞在為隨后的受精過程所需的能量代謝做充分的準備。
　　在上述研究過程中發(fā)現(xiàn)，樣品中小分子量、低豐度蛋白在進行質譜鑒定時，產生可測序肽段的數量少，其信號極

9、易受高豐度蛋白信號的抑制和掩蓋，致使小分子量、低豐度蛋白無法被鑒定出來，而這些小分子量、低豐度蛋白又具有極其重要的生理功能。為此，研究發(fā)展了一種能有效分離、富集小分子量、低豐度蛋白質和去除高豐度蛋白的“Gel-filter”的凝膠分離方法。結果顯示，隨著血清樣品上樣量的增加，小分子量蛋白條帶逐漸加深，表明隨著蛋白量的增加，富集效果明顯。經過該方法處理的樣品，蛋白質相對豐度不發(fā)生改變。將該方法與文獻報道的其他三種常用分離方法進行了比較，并

10、利用質譜技術進行鑒定分析。結果顯示，Gel-filter方法共鑒定到559(FDR＜1％)種血清小分子量蛋白質，為四種方法中鑒定數最高。對鑒定的小分子量蛋白、肽段進行分子量分布分析顯示，在各分子量區(qū)間，Gel-filter方法的鑒定數為四種方法中最高。以譜圖數表示蛋白的豐度并進行歸一化后對四種方法共同鑒定的小分子量蛋白豐度分布進行分析，Gel-filter方法富集的小分子量蛋白豐度分布范圍相對較寬。通過Gel-filter方法富集到的小

11、分子量蛋白可獲得更高的蛋白序列覆蓋度。為進一步評估不同方法小分子量蛋白的回收效率，通過在血清樣品中加入大腸桿菌誘導表達的輕穩(wěn)定同位素標記的GST蛋白(26kDa)后，分別經不同方法處理。質譜鑒定分析顯示，Gel-filter方法處理GST蛋白的回收效率為33.1±0.01％，顯著高于Differential solubilization(DS)和ProteoMiner試劑盒方法，后兩種方法處理GST蛋白的回收效率分別為18.7±0.01