基因轉(zhuǎn)染飼養(yǎng)細胞對造血干-祖細胞體外增殖和自我更新的影響及分子機制的研究.pdf

1、目的：
　　 比較人白血病抑制因子(hLIF)的不同添加方式對臍血造血干/祖細胞體外增殖過程中自我更新和歸巢潛能的影響，并研究hLIF對JAK/STAT信號通路的激活作用及其在維持造血干細胞增殖和自我更新過程中的分子機制。
　　 方法：
　　 1.將本科室構(gòu)建成功并鑒定正確的重組腺病毒載體Ad-hLIF和Ad-GFP體外感染W(wǎng)I-38細胞(一組為重組腺病毒直接感染W(wǎng)I-38細胞，另一組為先將WI-38細胞接種于絲

2、素膜上，再用腺病毒感染)，經(jīng)RT-PCR、ELISA法檢測hLIF在飼養(yǎng)層細胞中的表達。
　　 2.將Ad-hLIF及Ad-GFP等感染的WI-38細胞作為臍血造血干/祖細胞體外培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細胞(或直接添加hLIF)，并以細胞因子等組作為對照，體外培養(yǎng)7d后，通過流式細胞儀檢測法和Transwell法，比較各組干細胞體外培養(yǎng)后細胞表面黏附分子的表達變化，以判斷細胞的分化及歸巢潛能，并培養(yǎng)30d后觀測各組細胞的擴增情況。
　

3、　 3.在基因轉(zhuǎn)染飼養(yǎng)層組、空載體組和細胞因子組共培養(yǎng)體系中中加入JAK/STAT信號通路的特異性阻斷劑AG490，并設(shè)無阻斷劑的對照組，共培養(yǎng)7d后流式細胞術(shù)檢測表面黏附分子的表達量，Transwell法檢測干細胞的歸巢能力。
　　 4.RT-PCR法和免疫細胞化學(xué)法檢測各實驗組和對照組細胞中STAT3的轉(zhuǎn)錄和表達。
　　 5.Western blot法檢測各培養(yǎng)體系干細胞中p-STAT3和活化的蛋白激酶p-JAK1

4、、p-JAK2的表達變化，做28d的長期培養(yǎng)后進行細胞計數(shù)，繪制細胞生長曲線，并在不同時間點流式細胞術(shù)檢測CD34+的比例，比較阻斷前后干細胞自我更新能力的維持。
　　 結(jié)果：
　　 1.用RT-PCR、ELISA法檢測到轉(zhuǎn)染Ad-hLIF的WI-38飼養(yǎng)層細胞中有hLIF基因的轉(zhuǎn)錄和表達；
　　 2.造血干/祖細胞直接加在飼養(yǎng)層上面和飼養(yǎng)層細胞懸浮于干細胞培養(yǎng)體系中均能對造血干細胞的體外擴增和自我更新發(fā)揮重要作

5、用，兩者之間沒有顯著差異，直接添加hLIF的方式對干細胞體外擴增和自我更新能力的維持作用顯著低于前兩種添加方式；
　　 3.加入JAK/STAT信號通路的阻斷劑后，干細胞表面黏附分子的表達和體外歸巢能力均降低，RT-PCR法和免疫細胞化學(xué)法檢測到加入阻斷劑前后干細胞中STAT3的轉(zhuǎn)錄和表達沒有明顯變化；
　　 4.Western blot法檢測到加入阻斷劑后干細胞中STAT3和蛋白酪氨酸激酶JAK1、JAK2的活化明顯受

6、到抑制，并且加入阻斷劑后干細胞增長速度明顯變慢，相同時間點加入阻斷劑培養(yǎng)的干細胞CD34+比例低于未添加組，兩者間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.干細胞直接加于飼養(yǎng)層細胞上或飼養(yǎng)層細胞懸浮于干細胞培養(yǎng)體系中均對造血干細胞體外擴增和維持自我更新發(fā)揮重要作用，兩者間無顯著差異；
　　 2.飼養(yǎng)層細胞分泌hLIF的添加方式明顯優(yōu)于直接添加細胞因子hLIF；
　　 3.飼養(yǎng)層分泌的hLIF可以成功激