重組恥垢分枝桿菌在小鼠體內誘導的免疫應答、保護力及對感染小鼠的免疫治療作用.pdf

1、背景：
　　恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一種生長快、轉化效率高的非致病性分枝桿菌。研究顯示其1-3小時便可繁殖一代，生長速率是卡介苗（BCG）的10倍。低劑量的恥垢分枝桿菌對人、小鼠和豚鼠均不致病，并能很快被機體清除。恥垢分枝桿菌表達外源蛋白的水平可達結核分枝桿菌（MTB）的5-10倍，單位時間內分泌的蛋白產量比MTB高50-100倍?；谝陨蟽?yōu)勢，恥垢分枝桿菌有望成為代替BCG的有效疫苗

2、載體。已有的研究證實，MTB肝素結合血凝素（HBHA）抗原對 MTB感染具有明確的治療效果，而人白介素12（hIL-12）在針對胞內菌的細胞免疫中起著關鍵作用。因此，構建表達HBHA與hIL-12融合蛋白的重組恥垢分枝桿菌可通過融合基因表達產物有效提高單個優(yōu)勢抗原的免疫原性；另一方面，重組恥垢分枝桿菌能夠集中靶抗原和活載體的優(yōu)勢，可能提高HBHA誘導機體產生免疫應答的水平和保護力，增強巨噬細胞對體內 MTB的清除作用。
　　目的：

3、
　　采用分子生物學技術，構建了表達HBHA與hIL-12融合基因的重組恥垢分枝桿菌，并通過檢測其在小鼠體內誘導的免疫應答、保護力和對感染小鼠的免疫治療作用，以期為結核病的預防和治療提供新的有效候選疫苗。
　　實驗方法和結果：
　　1.重組恥垢分枝桿菌的構建及鑒定
　　根據GeneBank中查找到的結核分枝桿菌肝素結合血凝素（hbha）基因及人白介素12（hil-12）基因，分別設計兩段基因的引物，用分子生物學技

4、術構建分枝桿菌穿梭表達質粒 pSMT3-HBHA-hIL12，并用電穿孔法將重組質粒轉入恥垢分枝桿菌中。采用免疫熒光法和蛋白質印跡（Western blot），分別檢測HBHA和hIL-12蛋白在重組恥垢分枝桿菌中的表達，并通過檢測培養(yǎng)物OD600的吸光度，確定重組恥垢分枝桿菌生長狀態(tài)未發(fā)生明顯改變。
　　2.重組恥垢分枝桿菌在小鼠體內誘導的免疫應答及保護力
　　將表達HBHA和hIL-12融合蛋白的重組恥垢分枝桿菌采用同源

5、加強免疫的方法免疫小鼠，測定重組恥垢分枝桿菌在小鼠體內誘導產生的免疫應答水平，檢測小鼠外周血中IFN-γ、IL-2和IL-12的表達水平和CD4+、CD8+T細胞在外周血中所占的比例。并用結核分枝桿菌感染免疫小鼠，通過檢測小鼠肺部荷菌量和組織病理變化評價該重組恥垢分枝桿菌誘導的保護力。結果顯示重組恥垢分枝桿菌誘導小鼠產生以IFN-γ、IL-2分泌量增加為主的Th1型免疫應答，能有效減少感染小鼠肺部結核分枝桿菌的荷菌量，并能有效減輕其病理

6、損傷，誘導小鼠產生與BCG相當的保護作用，因此該重組恥垢分枝桿菌可能成為控制結核病的有效疫苗。
　　3.重組恥垢分枝桿菌對感染小鼠的治療作用
　　結核分枝桿菌感染小鼠4w后，皮下接種重組恥垢分枝桿菌，檢測免疫小鼠肺部荷菌量和組織病理變化。結果顯示，重組恥垢分枝桿菌雖然不及化療藥物顯著降低肺部荷菌量，但可以有效控制感染小鼠肺部結核分枝桿菌的荷菌量并減輕病理損傷。
　　結論：
　　表達HBHA和hIL-12融合蛋白的