一個(gè)控制水稻葉綠體發(fā)育基因WLP2的圖位克隆與功能分析.pdf

1、水稻作為世界上最主要的糧食作物之一，其產(chǎn)量在全球糧食問題中起著舉足輕重的作用。一切動(dòng)物植物的能量最終來源都是太陽能，而光合作用作為生命最重要的能量代謝過程，其效率直接決定水稻的產(chǎn)量以及品質(zhì)等性狀。作為光合反應(yīng)的發(fā)生器，研究葉綠體的發(fā)育進(jìn)程及其調(diào)控光合效率機(jī)理，具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。本研究利用EMS化學(xué)誘變的方法發(fā)現(xiàn)的高溫白葉白穗突變體wlp2為材料，通過圖位克隆的方法分離到目的基因WLP2，該基因編碼一個(gè)參與調(diào)控水稻葉綠體基因轉(zhuǎn)

2、錄激活復(fù)合體蛋白酶------類果糖激酶1，其功能缺失導(dǎo)致水稻葉綠體發(fā)育紊亂且高溫白化致死。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1、突變體wlp2存在兩個(gè)等位突變（wlp2-1，wlp2-2），在限制性溫度34℃條件下，突變體wlp2-1，wlp2-2葉片在2，3葉期均表現(xiàn)為白化，且最終導(dǎo)致整個(gè)植株死亡;在低溫22℃條件下，突變體wlp2-2表型與野生型一致，wlp2-1仍表現(xiàn)為基部葉白化;不同年份田間種植發(fā)現(xiàn)抽穗時(shí)溫度越高突變體白葉白穗

3、現(xiàn)象越嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致葉鞘莖干白化、株高矮化。農(nóng)藝性狀考察發(fā)現(xiàn)，高溫年份突變體wlp2結(jié)實(shí)率、千粒重、產(chǎn)量比野生型顯著下降。葉綠素含量測定表明，隨著溫度升高，突變體wlp2-1，wlp2-2葉綠素含量下降越顯著。葉綠體超微結(jié)構(gòu)分析表明，高溫條件下wlp2突變體與野生型相比，葉綠體數(shù)目變少，體積變小，嗜鋨小體明顯增多，沒有分化出明顯的片層結(jié)構(gòu);抽穗期凈光合速率測定分析表明，突變體光合速率顯著低于野生型。
　　2、遺傳分析表明，wlp2

4、突變表型是受一對(duì)單隱性核基因控制。本研究首先利用wlp2突變體與Nanjing-11雜交衍生的F2群體中的2348個(gè)突變表型單株，將該基因定位于第1染色體長臂上206.5kb范圍內(nèi)。利用基因分析與預(yù)測網(wǎng)站，發(fā)現(xiàn)該區(qū)間有35個(gè)開放閱讀框，分別擴(kuò)增測序野生型和wlp2突變體的這些基因，發(fā)現(xiàn)wlp2-1在LOC_0s01g63220第距離起始密碼子674bp處堿基G突變?yōu)锳，導(dǎo)致甘氨酸變?yōu)樘於彼?，等位突變體wlp2-2在第580bp處由堿基

5、C突變?yōu)門，導(dǎo)致脯氨酸變?yōu)榱涟彼?。通過轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)了LOC_0s01g63220就是目標(biāo)基因WLP2。
　　3、生物信息學(xué)分析表明，WLP2編碼含有pfkB-type保守結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶，是AtFLN1在水稻里的同源基因，而AtFLN1在擬南芥以及芥菜中是葉綠體基因轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體TAC的重要底物，與質(zhì)體RNA聚合酶核心亞基作用，進(jìn)而參與葉綠體的發(fā)育過程。
　　4、應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，分析了田間始穗期野生型WL

6、P2基因在不同組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明在葉片中的表達(dá)量最高，葉鞘、幼穗和莖中次之，在根中的表達(dá)量最低，與GUS染色的結(jié)果一致;幼苗期不同組織定量表達(dá)分析表明WLP2在第4葉表達(dá)水平最高，暗示著WLP2可能是參與成熟葉綠體發(fā)育進(jìn)程;亞細(xì)胞定位研究表明，WLP2定位在葉綠體中;此外光響應(yīng)定量分析表明，WLP2表達(dá)量隨著光照時(shí)間先上升后下降;突變體中質(zhì)體RNA聚合酶介導(dǎo)的基因表達(dá)水平與野生型相比顯著下降，且溫度越高表達(dá)下降越明顯，與溫度越高

7、突變體表型越嚴(yán)重楣一致。
　　5、酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)研究發(fā)現(xiàn)WLP2能質(zhì)體硫氧還蛋白OsTrxZ互作，且OsTrxZ又能與類果糖激酶2OsFLN2互作。以上結(jié)果表明:WLP2與OsTrxZ、OsFLN2組成質(zhì)體轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體(TAC)亞基且WLP2和OsFLN2可能作為OsTrxZ的靶蛋白，共同調(diào)節(jié)PEP聚合酶的活性，從而調(diào)控質(zhì)體基因表達(dá)進(jìn)而影響葉綠體的發(fā)育以及葉綠素的合成。利用CRISPR-Cas9編輯技術(shù)，構(gòu)建Wlp2