大鼠出生后聽皮層神經元電生理特性的發(fā)育變化及聽覺丘腦-皮層腦片突觸傳遞的研究.pdf

1、動物出生后2-4周，聽覺通路的各個部分及彼此之間的神經纖維聯系逐漸發(fā)育成熟并構成一個完整的神經回路。位于丘腦的內側膝狀體(medialgeniculatebody，MGB)是特異的聽覺中繼站，其神經元發(fā)出的上行性纖維呈扇形經內囊投射至初級聽皮層(primararyauditorycortex，A1，Te1)及其它聽覺皮層的相應區(qū)域，其中始于內側膝狀體腹側部(theventralpartionofmedialgeniculatebody，

2、MGBv)的聽覺丘腦皮層上行通路稱為初級聽覺丘腦皮層通路，主要介導對聲刺激的短潛伏期反應以及運載關于刺激頻率、強度和時程的精確信息，并且影響初級聽皮層神經元對輸入信息的處理及反應形式，在聽覺系統中起著非常重要的作用。 隨著膜片鉗技術的不斷成熟，不僅可在傳統的冠狀或是矢狀位的腦片切片上分別研究MGB或初級聽皮層神經元的電生理特性的發(fā)育變化，而且根據對大鼠聽覺丘腦一皮層投射纖維的穩(wěn)定走行的長期解剖學方面的研究結果，通過改換腦片切片時

3、的角度可以在離體腦片上保存好MGBv與初級聽皮層(primararyauditorycortex，A1)以及二者之間的較完整的纖維聯系，從而使得在腦片上對更大范圍的聽覺神經元間突觸傳遞機制的研究成為可行，并且可以在腦片上極其便利的了解A1神經元對傳入信息所發(fā)生的突觸后反應及其細胞機制。 為此，本課題采用腦片膜片鉗技術和方法，對出生后P3-30d的大鼠A1神經元的電生理及形態(tài)學特性的發(fā)育變化進行較系統的了解，以及在聽覺丘腦皮層腦片

4、上研究刺激MGB或聽覺丘腦-皮層通路誘發(fā)的A1神經元突觸后電生理學反應的形式及特點。 第一部分：采用腦片膜片鉗全細胞記錄技術，研究出生后不同發(fā)育階段大鼠的A1神經元膜學特性、電壓依賴性離子通道變化，及biocytin細胞內染色，結果顯示如下：1.P3-11d(postnatalday，出生后)，不同天齡A1神經元的RMP(restingmembranepotential)、Ri(inputresistance)和Tau(time

5、constant)的差異非常顯著，P12d后基本不再發(fā)生變化。在P3-12d的發(fā)育期，膜電位從-40mV超極化至-68mV。靜息膜電位的超極化可能與Na+/K+泵活性增強以及K+電流的增加或cl-翻轉電位的降低有關。隨著膜面積的延伸，離子通道密度相應增加可解釋在發(fā)育過程中輸入阻抗的降低。 2.不同天齡A1神經元動作電位幅度和時程在P3-11d差異顯著，之后基本不再發(fā)生變化。 3.在A1神經元發(fā)育過程中，其電壓依賴性離子通

6、道的變化影響了出生后大鼠A1神經元動作電位的形態(tài)。電流鉗記錄方式下，10μmol/L的K+通道阻斷劑4-AP使P8d大鼠聽皮層神經元動作電位幅度降低，時程變寬，動作電位的數目減少，使P13d大鼠聽皮層神經元動作電位逐漸降低至脈沖終末達到平臺電位，說明電壓依賴性K+在出生后大鼠聽皮層神經元上還未發(fā)育成熟。300nmol/L的Na+通道阻斷劑TTX對P8d和P13d大鼠聽皮層神經元動作電位的作用基本相似，使動作電位的發(fā)放減弱或消失，僅見LT

7、S，表明Na+通道在出生后發(fā)育已較成熟。50μmol/L的Ca2+通道阻斷劑CdCl2引起P8d的聽皮層神經元動作電位的發(fā)放逐漸減弱，在脈沖終末達到平臺電位，而僅使P13d的聽皮層神經元動作電位的幅度降低，時程延長，表明Ca2+對聽皮層幼稚神經元動作電位的維持發(fā)揮了重要的作用。 4.采用腦片膜片鉗全細胞記錄和細胞內染色相結合的技術，觀察大鼠出生后不同發(fā)育階段的A1神經元形態(tài)的變化。Biocytin組化染色結果表明，隨著出生后天齡

8、的增長，A1神經元胞體逐漸呈錐形、短梭形或長梭形，軸突出現較早，軸突自胞體或主樹突近胞體處發(fā)出，樹突發(fā)育相對較晚，但隨著出生后天齡的增長其變化更為明顯，表現為樹突增粗增長，分支增多，樹突野范圍增大，并出現樹突棘。聽皮層超微結構顯示，P3-30d神經氈面積逐漸增大，膠質細胞逐漸增多，高爾基器等神經元細胞器發(fā)達。這些結果說明，大鼠聽皮層及其神經元形態(tài)在出生后尚未發(fā)育成熟，需經過一定時間才能達到成年水平。 第二部分：改換腦片切片的角度

9、，使腦片包含有部分MGBv和A1神經元及其之間較完整的丘腦皮層神經纖維突觸聯系，通過biocytin細胞外染色以及刺激MGBv神經元或丘腦-皮層投射纖維引出皮層神經元的突觸后反應證明聽覺丘腦皮層通路的存在，觀察A1神經元突觸后電活動反應形式及特點，了解突觸傳遞在A1神經元對傳入信息的整合及處理中的作用機制。結果如下：1.聽覺丘腦-皮層腦片制備由于初級聽覺丘腦皮層通路和次級聽覺丘腦皮層通路相互交叉或重疊，盡管它們的功能不同，但是目前的丘腦

10、皮層腦片還無法將它們分別獨立出來進行研究。聽覺丘腦-皮層通路在走行上有幾個轉折點，所以使得400μm厚的腦片往往不能包含一個較完整的丘腦-皮層系統，刺激MG時，較少能引起皮層的反應，僅在刺激丘腦-皮層通路中的上丘輻射部分時可以引出皮層反應。為了獲得較為完整的丘腦-皮層通路，將切片的厚度由400μm調整至600μm后可以獲得含有完整丘腦-皮層通路的腦片，刺激MG均可記錄到清晰的，短潛伏期的皮層反應。 2.早和晚的突觸后電流將記錄電

11、極置于聽皮層的第Ⅱ-Ⅳ層，通過在亞皮層刺激位點給予幅度0.5mA，時程100μs的刺激可以在A1細胞誘導出含有早和晚反應成分的突觸后電流(postsynapticcurrents，PSCs)。突觸后電流在細胞膜去極化時幅度減小，而超極化時增大。選擇性的應用谷氨酸鹽受體拮抗劑證明谷氨酸鹽受體在突觸后電流產生中的作用。NMDA受體拮抗劑APV(25-50μM)可使早電流成分稍減小，但是可完全阻斷晚電流成分。AMPA/KA受體拮抗劑CNQX(