人假想鎂離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在胃癌細(xì)胞多藥耐藥性形成中的作用及機(jī)制.pdf

1、該課題擬制備HPT蛋白的抗體檢測(cè)SGC7901及SGC7901/ADR細(xì)胞中HPT蛋白的表達(dá)差異;并采用正反義核酸技術(shù)進(jìn)一步研究HPT在胃癌細(xì)胞MDR形成中的作用,初步探討其可能的作用機(jī)制,以期為逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞MDR的研究奠定基礎(chǔ).【目的】(1)構(gòu)建HPT原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)HPT蛋白,免疫小鼠制備抗血清并檢測(cè)其在胃癌耐藥細(xì)胞中的表達(dá);(2)構(gòu)建HPT正、反義核酸真核表達(dá)載體,分別轉(zhuǎn)染SGC7901和SGC7901/ADR細(xì)胞,研究HPT

2、與胃癌細(xì)胞MDR的相關(guān)性及其可能的機(jī)制.【方法】(1)在克隆成功HPT基因cDNA的基礎(chǔ)上,采用DNA重組技術(shù)構(gòu)建其原核表達(dá)載體pRSETB/HPT,酶切鑒定;(2)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌BL21體內(nèi)表達(dá)HPT與6×His的融合蛋白,并以SDS-PAGE和Western blot鑒定;(3)用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝膠顆粒免疫BALB/c小鼠制備抗血清,用Western blot進(jìn)行鑒定;(4)以所制備的抗血清檢測(cè)HPT蛋白在胃癌耐藥

3、細(xì)胞系SGC7901/ADR及其敏感親本細(xì)胞系SGC7901中的表達(dá);(5)采用分子克隆技術(shù),將HPT基因全長cDNA片段分別按正、反方向克隆入真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)的多克隆位點(diǎn)之間,構(gòu)建HPT正、反義核酸,酶切鑒定;(6)用脂質(zhì)體介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)染HPT正、反義核酸入胃癌藥敏細(xì)胞SGC7901及耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR,經(jīng)G418篩選,Western blot法鑒定獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染克隆;(7)MTT法對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞進(jìn)行