水牛囊胚發(fā)育階段對原始態(tài)-始發(fā)態(tài)胚胎干細胞分離培養(yǎng)的影響.pdf

1、胚胎干細胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)的建系受其細胞來源以及培養(yǎng)環(huán)境等多種因素的影響，其中來自囊胚的ESCs受囊胚所處發(fā)育階段的影響最大。囊胚形成到囊胚植入子宮壁期間，其多能性細胞處于一種不斷自我更新和分化的過程，可能同時存在不同狀態(tài)的多能性細胞并最終決定其衍生的ESCs的多能性狀態(tài)。因此，本研究擬探討不同發(fā)育階段胚胎的多能性基因表達模式及其對分離培養(yǎng)水牛類ESCs效果的影響，并分析其所處的多能性狀態(tài)，以期確定

2、適合水牛類ESCs分離培養(yǎng)的囊胚發(fā)育階段。
　　首先，對水牛不同發(fā)育階段早期胚胎（桑椹胚、早期囊胚、囊胚、擴張囊胚和孵化囊胚）的多能性相關(guān)基因的表達模式進行了分析，發(fā)現(xiàn)多能性基因主要在桑椹胚和早期囊胚表達，原始態(tài)相關(guān)基因KLF4、TBX3和REX-1在這兩個階段高水平表達;囊胚是一個相對沉默的基因表達時期，大部分多能性基因表達下調(diào);擴張囊胚中KLF4、TBX3和REX-1表達量較低且高表達始發(fā)態(tài)相關(guān)基因FGF5。對培養(yǎng)至第5天的水

3、牛胚胎進行2i(1μmol/mL PD0325901，3μmol/mL CHIR99021)培養(yǎng)處理，發(fā)現(xiàn)2i培養(yǎng)處理對水牛囊胚形成、囊胚細胞數(shù)、以及內(nèi)細胞團含量無顯著影響，其多能性基因表達模式與非處理組相似，但表達量均顯著低于對照組;其多能性沉默階段延長至擴張囊胚和孵化囊胚。
　　其次，比較了不同發(fā)育階段囊胚對分離培養(yǎng)水牛類ESCs的效果，并對所獲得的類ESCs進行了生物學特性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴張囊胚和孵化囊胚的ICM的貼壁率和

4、原始克隆形成率均顯著高于早期囊胚和囊胚;2i培養(yǎng)處理早期胚胎后，孵化囊胚源原始克隆直徑顯著大于對照組(P＜0.05);對不同來源水牛類ESCs原代克隆進行核心轉(zhuǎn)錄因子表達分析發(fā)現(xiàn)，其OCT4的表達不受囊胚時期來源和2i處理早期胚胎的影響，NANOG和SOX2在擴張囊胚源類ESCs的相對表達顯著高于孵化囊胚源類ESCs，2i處理早期胚胎組原始態(tài)基因KLF4、TBX3和REX-1的表達高于對照組，孵化囊胚TBX3和REX-1表達顯著高于擴張

5、囊胚源類ESCs。對傳代培養(yǎng)的水牛類ESCs進行生物學特性分析，發(fā)現(xiàn)細胞呈克隆樣生長，表達多能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4、NANOG、SOX2、c-MYC、CDH1、KLF4和TBX3;免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，其表達OCT4、SOX2蛋白，弱表達SSEA1、SSEA4和TRA-1-60表面抗原;經(jīng)誘導能形成可表達GATA4、TUBB3、ACTA2和AFP三個胚層標記基因的擬胚體，能分化形成成纖維樣、上皮樣和神經(jīng)樣細胞。
　　最后，通過檢測細胞X

6、性染色體活性狀態(tài)、相關(guān)多能性基因表達情況和對不同多能性信號的反應(yīng)，以分析雌性水牛類ESCs所處的多能性狀態(tài)。結(jié)果顯示:雌性水牛類ESCs有一條X染色體隨機失活;通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，水牛類ESCs表達原始態(tài)相關(guān)基因KLF4和TBX3，不表達REX-1，而表達始發(fā)態(tài)基因FGF5和ACTA2;免疫組化以及Western blot檢測再次證實水牛類ESCs表達FGF5，不表達REX-1;水牛類ESCs在細胞因子LIF和bFGF下較好維持其

7、多能性狀態(tài)，其次是與始發(fā)態(tài)相關(guān)的細胞因子bFGF和Noggin，在原始態(tài)相關(guān)細胞因子LIF+BMP4中較難維持其多能性狀態(tài)。水牛類ESCs的基因表達模式和對信號的反應(yīng)顯示與始發(fā)態(tài)多能性干細胞更接近。
　　以上結(jié)果表明:(1)水牛早期胚胎多能性基因表達主要集中在桑椹胚和早期囊胚，囊胚是水牛相對沉默的的多能性階段，但經(jīng)2i處理早期胚胎后囊胚的多能性沉默期延遲到擴張囊胚期;(2)水牛擴張囊胚和孵化囊胚有利于類ESCs的衍生，經(jīng)2i處理早