分子佐劑C3d增強豬流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的研究.pdf

1、豬流感(SI)是由豬流感病毒(SIV)引起的一種急性高度傳染性呼吸道疾病。目前，包括H1N1、H3N2和H1N2亞型在內的SI已成為危害許多國家豬群的疾病。而且，豬是禽、豬、人流感病毒的易感宿主，可最大限度地彼人等其他動物流感病毒和禽流感病毒所感染，成為流感病毒基因重組或重配的“混合器”，是流感病毒新流行毒株產生的“孵育器”。因此，豬流感的控制不僅有經濟上的意義，更有其深遠的公共衛(wèi)生學意義。目前，廣泛應用于臨床的是單價或多價的豬流感病毒

2、滅活疫苗。但豬流感病毒在雞胚中連續(xù)傳代有可能影響病毒的免疫原性。而且其免疫劑量大，同時還必須使用佐劑，從而增加了滅活疫苗的成本。因此，研制新一代疫苗以替代或作為滅活疫苗的有益補充就顯得尤其必要。另外，豬流感疫苗的研究應該盡可能兼顧目前主要流行的幾種亞型。DNA疫苗因為能夠同時誘導體液免疫應答和細胞免疫應答而受到青睞。基于豬流感病毒血凝素HA的DNA疫苗的研究已經取得了一定的效果。但由于DNA疫苗蛋白表達量低，激發(fā)的免疫應答較弱，從而限制

3、了它的應用。因此，提高DNA疫苗的免疫效果已成為基因免疫研究的熱點。一系列的研究表明，多拷貝的C3d分子與靶抗原偶聯(lián)極大地提高了特異抗原的免疫應答水平。另外，用DNA疫苗免疫后再用重組病毒加強免疫的prime-boost免疫策略也顯示了很好的免疫效果。本研究探討了上述兩種策略在豬流感疫苗上的應用效果。 為了探討分子佐劑C3d對豬流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的影響，本研究構建了四種表達不同形式HA的質粒DNA，分別為：表達分泌

4、型HA的質粒pCA-sHA，表達全長HA的質粒pCA-tmHA和融合表達三拷貝C3d(鼠源和豬源)與HA的質粒pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3。四種質粒與空載體pCAGGS分別免疫BALB/c小鼠后，分別用ELISA、HI試驗和中和試驗檢測抗HA抗體水平，并用硫氰酸鹽洗脫法檢測抗體親和力水平。結果顯示，免疫后第8周，pCA-sHA組與pCA-tmHA組的抗體水平沒有明顯差別，而pCA-sHA/mC3d3和pCA-s

5、HA/sC3d3免疫組的抗體水平顯著高于這兩組，并具有更強的抗體親和力。淋巴細胞增殖試驗及細胞因子檢測實驗結果顯示，免疫后第8周，pCA-tmHA誘導了更強的淋巴細胞增殖反應和更高水平的IFN-γ，而pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3誘導了更高水平的IL-4，結果說明，HA表達形式的變化影響了免疫反應的類型，C3d與HA融合后通過誘導IL-4的產生而使免疫反應傾向于Th2型。在隨后的同型或異型病毒攻擊試驗中，通過對攻

6、擊病毒的分離、攻擊病毒在免疫小鼠體內的分布情況以及攻毒后的免疫小鼠的病理變化的檢測，證實四種質粒DNA都在不同程度上加速了同型攻擊病毒的清除，對免疫小鼠產生了一定的保護作用。而pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3免疫的小鼠對異型毒的攻擊也產生了一定的保護作用。結果表明，三拷貝分子佐劑C3d與分泌型HA融合后顯著提高了DNA疫苗誘導的抗體水平，加速了抗體親和力成熟，并可以部分抵抗異型病毒的攻擊。另外，結果也表明，豬源補體

7、C3d可以用小鼠做模型來評價其分子佐劑的效力。 為了評價用DNA疫苗和重組病毒聯(lián)合免疫的效果，隨后進行了第二次免疫攻毒試驗。1-4組與5-8組分別免疫質粒pCA-sHA、pCA-tmHA、pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3，初次免疫后，間隔4周，1-4組再用同一種質粒加強免疫一次，5-8組用表達H3N2亞型豬流感病毒HA的重組偽狂犬病毒rPRV-HA加強免疫一次；第9組初次免疫用pCAGGS空載體，4周后用r

8、PRV-HA加強免疫：第10組免疫PRVBartha-K61疫苗株；第11組為不免疫不攻毒組對照。血清學分析結果顯示，對于rPRV-HA加強免疫組，在有DNA疫苗作基礎免疫的組，抗體水平高于rPRV-HA單獨免疫組。用DNA疫苗加強免疫與用rPRV-HA加強免疫誘導的抗體水平沒有明顯差別。但質粒pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3做基礎免疫組的抗體水平要顯著高于質粒pCA-sHA、pCA-tmHA做基礎免疫的組。這表明

9、，與C3d共表達的融合形式HA不但增強了抗體應答，而且引發(fā)了良好的抗體免疫記憶，因此，在用rPRV-HA加強免疫后，抗體水平迅速上升，在加強免疫后第4周抗體水平顯著高于其他組。細胞因子檢測實驗結果顯示，DNA疫苗與rPRV-HA聯(lián)合免疫組的IL-4和IFN-γ的水平顯著高于rPRV-HA單獨免疫組。并且，用rPRV-HA加強免疫誘導的IL-4和IFN-γ的水平高于用同種DNA疫苗加強免疫誘導的細胞因子水平。結果表明，用rPRV-HA加強

10、免疫普遍增強了免疫應答。在隨后的同型豬流感病毒的攻擊試驗中，各免疫組都在不同程度上加速了同型攻擊病毒的清除，對免疫小鼠產生了一定的保護作用。其中，用質粒DNA免疫后再用rPRV-HA加強免疫產生了最好的保護作用。 本研究構建的融合表達3拷貝C3d與HA的質粒DNA可能作為豬流感的候選疫苗，為預防多種亞型豬流感疫苗的研究探索了新的思路。另外，用質粒DNA做基礎免疫再用rPRV-HA加強免疫的免疫策略，也為豬流感疫苗的研究提供了新的