蛋白激酶SPAK在海水吸入型肺損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:
　　溺水是一個(gè)非常危險(xiǎn)的公共傷害事件,但是卻常常被人們忽略。它是僅次于道路交通事故的第二大意外傷害的原因,尤其在青少年群體當(dāng)中更為突出。水經(jīng)口鼻吸入到肺,可以破壞肺泡上皮的屏障功能,導(dǎo)致肺水腫及炎癥反應(yīng),進(jìn)而急性肺損傷(acute lung injury,ALI),嚴(yán)重時(shí)還可以進(jìn)展成為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。先前的研究已經(jīng)表明,海水吸入引起

2、肺損傷主要是由于高滲的刺激引起核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)的磷酸化激活和炎癥因子的釋放。然而NF-κB在海水吸入型肺損傷(seawater inhalation induced acute lung injury,SWI-ALI)中的作用機(jī)制并未完全闡明。
　　STE20相關(guān)脯氨酸丙氨酸豐富的蛋白激酶(Ste20-like proline-/alanine-rich kinase,SPAK)屬于STE20激酶家族中的重要成員。 S

3、PAK廣泛表達(dá)在許多物種和多種器官、組織中。SPAK的最主要功能是磷酸化和激活Na+-K+-2CL-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Na-K-Cl cotransporter,NKCC)。NKCC是一個(gè)重要的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,介導(dǎo)了許多病理?xiàng)l件下的炎癥反應(yīng)。除此之外,SPAK在細(xì)胞增殖和分化,以及腸道炎癥的調(diào)控方面也展現(xiàn)出了重要的作用。在很多實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明,SPAK可以激活p38通路,表明其在介導(dǎo)高滲引起的炎癥反應(yīng)方面起著至關(guān)重要的作用。研究表明,在高滲誘導(dǎo)

4、
　　小鼠結(jié)腸炎性腸病模型中,SPAK的過高表達(dá)可以加劇小鼠的結(jié)腸炎的程度,其原因可能與 SPAK的過高表達(dá)引起了腸壁上皮細(xì)胞屏障功能的障礙以及腸壁細(xì)胞炎性細(xì)胞因子釋放的增加有關(guān)。據(jù)此,我們推測,SPAK可能以類似的機(jī)制也參與到了海水吸入型肺損傷時(shí)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　1.通過復(fù)制海水吸入型肺損傷模型,觀察海水吸入后肺組織SPAK表達(dá)的變化。
　　2.研究引起SPAK表達(dá)變化的調(diào)節(jié)通路,明確其上游

5、的調(diào)節(jié)分子。
　　3.通過siRNA技術(shù)干擾SPAK的表達(dá),研究SPAK在海水刺激時(shí)所起到的作用及其病理生理機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　健康的雄性SD大鼠共30只,根據(jù)電腦產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù),將其排序并分為5組,分別為:正常組(N)、海水吸入1小時(shí)組(1H)、海水吸入3小時(shí)組(3H)、海水吸入6小時(shí)組(6H)、海水吸入12小時(shí)組(12H)。每組各有大鼠6只。從大鼠的頸部正中間突出部分切口,分開氣管前的甲狀

6、腺和肌肉組織以暴露氣管,經(jīng)氣管向肺內(nèi)緩慢地注入預(yù)先配制好的海水。劑量為4ml/kg,時(shí)間為4min。觀察注入海水后大鼠的表現(xiàn),出現(xiàn)呼吸急促,經(jīng)口鼻溢出粉紅色的泡沫樣分泌物,初步確認(rèn)動(dòng)物模型建立成功。在海水吸入后的1h、3h、6h、12h分別將大鼠放血處死,并收集、保存相關(guān)的標(biāo)本。正常組的大鼠不注入海水,其余處理與實(shí)驗(yàn)組相同。
　　(1)將各組的大鼠放血處死后所獲得的右下肺臟標(biāo)本用紗布輕輕擦干,然后置于分析天平上進(jìn)行稱重,即獲得肺組

7、織的濕重。烘干后稱重并記錄肺組織的干重,計(jì)算得到肺的濕干比。肺組織的濕干比反映了肺臟水腫的嚴(yán)重程度。(2)將組織塊切成5μm厚的組織切片,進(jìn)行H-E染色,觀察肺組織的結(jié)構(gòu)變化。(3)通過ELISA方法檢測各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α及IL-1β含量的變化。(4)選用免疫組織化學(xué)染色的方法觀察各組大鼠肺組織中 SPAK蛋白的表達(dá)情況,包括表達(dá)的部位和表達(dá)的程度。(6)通過蛋白質(zhì)印跡方法檢測海水吸入后肺組織中SPAK表達(dá)的改變。(7)通過

8、RT-PCR方法檢測SPAK轉(zhuǎn)錄水平的改變。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　本部分為細(xì)胞實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)中所選擇的細(xì)胞為大鼠肺泡巨噬細(xì)胞:即 NR8383細(xì)胞。按時(shí)更換培養(yǎng)基傳代,保證細(xì)胞處于對數(shù)生長期進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)將細(xì)胞離心分離,然后更換無血清培養(yǎng)基。將細(xì)胞分成三組:正常組、海水處理組和PDTC預(yù)處理+海水組。各組的處理為:正常組不做特殊的處理,海水處理組將培養(yǎng)基更換為含有25％配方海水的培養(yǎng)基,PDTC預(yù)處理組在更換含有25%配

9、方海水的培養(yǎng)基前30分鐘給予 PDTC(200μM)預(yù)處理。其余處理同海水處理組。4小時(shí)后離心收集上清液和細(xì)胞。(1)通過Western blot方法測定PDTC預(yù)處理對海水引起的SPAK表達(dá)變化有無抑制作用。(2)通過siRNA干擾SPAK的表達(dá),然后測定細(xì)胞上清液中TNF-α及IL-1β含量的改變,從而反映SPAK在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)方面的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　1.吸入海水后肺組織的濕干比與正常情況下

10、相比明顯增大(P<0.001),顯示海水吸入可以造成肺部明顯的水腫。
　　2.HE染色結(jié)果顯示吸入海水后肺臟肉眼可見體積膨脹、增大,呈血紅色,表面散布出血點(diǎn);光鏡下觀察可見肺泡壁增厚,有明顯的水腫跡象,肺泡腔內(nèi)可見炎性滲出,肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞。
　　3.吸入海水后肺內(nèi)細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α、IL-1β與正常情況對比有明顯的增多(P<0.05),且隨著時(shí)間而不斷累積,在6小時(shí)左右達(dá)到最大值。
　　4.免疫組化染色結(jié)果顯

11、示與正常組相比,海水吸入組中代表SPAK表達(dá)的深棕染的細(xì)胞明顯增多,且在細(xì)胞漿和細(xì)胞核均有分布,表明吸入海水后在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中SPAK表達(dá)明顯升高。
　　5.Western blot結(jié)果顯示吸入海水后肺組織受海水刺激的影響,SPAK蛋白表達(dá)明顯增加,最高可達(dá)對照組的2.7倍左右。
　　6.PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組SPAK轉(zhuǎn)錄較正常情況明顯升高,在3小時(shí)左右達(dá)到頂峰,約為正常水平的3.2倍左右。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　1

12、.海水刺激可以明顯增加 NR8383細(xì)胞中磷酸化 NF-κB占總 NF-κB的比值,而NF-κB的抑制劑PDTC的預(yù)處理可以明顯抑制這一反應(yīng)。PDTC的預(yù)處理同樣可以抑制海水刺激引起細(xì)胞中SPAK的轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的升高。
　　2.海水的刺激可以明顯的增加細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-1β的釋放,而在SPAK表達(dá)下調(diào)的細(xì)胞中,海水刺激雖然也可以引起炎癥因子釋放的增加,但與未干擾組相比,釋放量明顯減少,表明炎癥反應(yīng)受到了一定程度的抑制