人組織激肽釋放酶cDNA的克隆、表達及其基因治療高血壓的初步研究.pdf

1、人組織激肽釋放酶(human tissue kallikrein,KLKI)是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的核心成員,能裂解激肽原的特異肽鍵而釋放激肽,并通過該系統(tǒng)發(fā)揮一系列的生物學功能.該研究的目的是開發(fā)人組織激肽釋放酶基因工程產品,制備鑒定KLKI的試劑,并探討用KLKI基因治療高血壓的可行性.根據國際上發(fā)表的KLKI cDNA序列,以人胰腺cDNA第一鏈為模板,擴增KLKI cDNA,所得的KLKI cDNA與已經發(fā)表的KLKI cDNA

2、序列完全相同或有幾個核苷酸差異.將KLKI cDNA的信號肽切除,按正確的閱讀框架克隆入pGEX-4T-3載體中谷胱苷肽-S-轉移酶(GST)基因的下游,用IPTG誘導實現(xiàn)其在大腸桿菌中的表達.Western-blotting結果顯示,表達的約48kDa的融合蛋白能夠被GST單抗特異性識別.以原核表達產物為抗原,分別制備了針對KLKI的多抗血清和單克隆抗體.以KLKI的重組載體注射小鼠也獲得了較高效價的特異抗體.把KLKI cDNA克隆

3、入真核表達載體pcDNA3中,通過多聚乙酸亞胺介導將真核表達重組載體轉染入COS-1細胞,用所制備的抗體做間接免疫熒光反應,結果說明KLKI在真核細胞中獲得了表達.通過注射此重組真核表達載體基因治療自發(fā)性高血壓大鼠(SHR),降壓幅度達30mmHg,維持2周左右.將KLKI cDNA克隆入該室構建的乳腺特異性表達載體p205C3中,用獲得的重組載體注射哺乳期小鼠中,乳汁中的KLKI活性高達292U/ml.這些結果表明,該試驗克隆的KLK