基因槍介導的DSP為載體的基因轉染初步研究.pdf

1、背景:隨著近代生物技術的發(fā)展與人類基因庫的不斷完善,人們在理論上和實踐上的不斷探索,基因治療對許多疾病提供了一個新的治療途徑。所謂基因治療是指在基因水平上將有功能的基因或其他基因通過基因轉移方式導入患者體內,并使之表達正常的基因,或表達患者原來不存在或表達很低的外源基因?；蛑委煹幕緱l件包括:目的基因的獲取,靶細胞的選擇,將目的基因導入靶細胞的方法和途徑。目前基因載體的主要分為兩類:病毒載體或非病毒載體。非病毒載體具有的安全性,低免疫

2、原性等優(yōu)勢成為研究的重點。其中如何將目的基因有效的轉運到靶細胞或者靶部位是十分關鍵的步驟,基因槍作為純物理方式的非病毒轉染方法能夠方便、有效的轉運基因,已經越來越受到研究者的關注。
　　 目的:合成葡聚糖.精胺陽離子聚合物DSP,擴增和提取質粒DNApmcherry-c1和pEGFP-c3,研究以DSP為粘合劑制備基因槍子彈的方法,初步探討在同等條件下,用基因槍方法和普通轉染方法在體外的轉染能力比較,和用DSP作為粘合劑和用傳統(tǒng)

3、亞精胺作為粘合劑進行體外轉染能力的比較,以及用基因槍方法共轉染同單獨轉染能否發(fā)揮協(xié)同作用,提高轉染率的研究。
　　 方法:研究首先以平均分子量為40KDa的葡聚糖作為反應起始物,在室溫下經高碘酸鉀氧化6個小時,得到了氧化葡聚糖。通過鹽酸羥胺法測定了氧化葡聚糖醛基的含量,根據(jù)此含量按照1:1.25摩爾比的精胺與氧化葡聚糖反應,該反應能生成含希夫氏堿的葡聚糖.精胺亞胺聚合物,所得到的聚合物在過量硼氫化鈉作用下,可還原生成穩(wěn)定葡聚糖一

4、精胺共價陽離子聚合物(DSP)。DSP通過FT-IR及1 H-NMR其結構進行鑒定,并用三硝基笨磺酸法(TNBS)測定其醛基的含量。
　　 采用堿裂解法分別擴增和提取了具有紅色熒光蛋白的質粒pmcherry-c1和具有綠色熒光蛋白的質粒pEGFP-c3。首先將質粒DNA轉入到大腸桿菌中,增殖轉化的大腸桿菌擴增質粒DNA,然后采用堿裂解法從大腸桿菌中提取質粒DNA并采用質粒提取試劑盒除去其中的菌體殘片及內毒素等進行了純化。通過紫外

5、分光光度計測量其濃度和純度,并用瓊脂糖凝膠電泳進行了鑒定。
　　 制備了基因槍子彈,以DSP代替?zhèn)鹘y(tǒng)的亞精胺做為粘合劑制備基因槍子彈,以pmcherry-c1為報告基因,轟擊乳腺癌細胞(MCF-7),考察了基因槍轉染技術對細胞的轉染率和細胞的生存率的影響,并采用了星點設計-效應面法優(yōu)化了試驗的條件,通過熒光倒置顯微鏡觀察細胞的轉染情況并計算轉染率；MTT法考察復合物細胞毒性,在同等條件下以亞精胺法制備了基因槍子彈作為對照。在此基

6、礎上,研究了以DSP為粘合劑制備的基因槍子彈實現(xiàn)了兩種質粒pmcherry-c1和PEGFP-c3的共轉染,以亞精胺法制備了基因槍共轉染子彈作為對照。
　　 結果:所合成氧化葡聚糖醛基含量為7.27 mmol/g,DSP中接枝精胺的濃度為0.0214mg/ml。所提取的質粒DNA的純度(比值在1.8-2.0之間)pmcherry-c1A260/A280=1.94,pEGFP-c3 A260/A280=1.92,其濃度分別Cpmc

7、herry-c1=492.8ug/ml,CpEGFP-c3=498.1ug/ml.用DSP為載體,用化學方法轉染質粒pmcherry-c1,得到轉染率為14.8％,細胞生存率為83.2％。用所合成的DSP代替?zhèn)鹘y(tǒng)的亞精胺作為粘合劑,以質粒pmcherry-c1作為報告基因,制備了基因槍子彈,用星點設計.效應面法,優(yōu)化了用基因槍法轉染體外MCF-7細胞轉染條件。其優(yōu)化條件為:每發(fā)子彈含鎢粉的量為1.0mg,質粒DNA的量為1.2ug,基因

8、槍的壓力為1.5kpa,轟擊距離2cm。得到的轉染效率為22.1％,細胞生存率為52.2％,同通過模型預測值的偏差的絕對值為8.3％,6.1％。同時在同等條件下,用傳統(tǒng)的亞精胺法制備了基因槍子彈作為對照,轟擊細胞后得到其轉染率為15.8％,細胞生存率為54.5％。研究了以DSP為粘合劑制備的基因槍子彈實現(xiàn)了2種質粒pmcherry-cl和pEGFP-c3的共轉染,在每發(fā)子彈含鎢粉的量為1.0mg,質粒DNA的量為1.2ug,基因槍的壓力

9、為1.5kpa,轟擊距離2cm條件下,單獨轉染質粒pmeherry-cl得到轉染率為21.0％,單獨轉染質粒pEGFP-c3得到轉染率為19.9％,共同轉染這兩種質粒DNA得到轉染率為23.0％,同時,以同樣方法下以亞精胺法制備了基因槍,在同等條件下轉染細胞作為對照,單獨轉染質粒pmcherry-cl得到轉染率為15.5％,單獨轉染質粒pEGFP-c3得到轉染率為15.2％,共同轉染這兩種質粒DNA得到轉染率為17.9％。