赫賽汀聯(lián)合雷帕霉素對人胃癌細胞NCI-N87增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　 1.通過體外實驗觀察赫賽汀聯(lián)合雷帕霉素對人胃癌細胞NCI-N87增殖、凋亡及周期的影響，評價赫賽汀聯(lián)合雷帕霉素作用NCI-N87細胞是否存在協(xié)同作用;
　　 2.觀察赫賽汀聯(lián)合雷帕霉素對人胃癌細胞NCI-N87中Her2蛋白、P-Akt、P-mTOR、P-4E-BP1表達的影響，初步探討其誘導人胃癌細胞NCI-N87凋亡及下調相關蛋白的可能機制。
　　 方法:
　　 1.常規(guī)培養(yǎng)人胃癌細胞N

2、CI-N87。
　　 2.采用流式細胞術(flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測人胃癌細胞NCI-N87和SGC-7901中Her2蛋白表達情況。
　　 3.赫賽汀、雷帕霉素單藥及聯(lián)合作用NCI-N87細胞后，采用四甲基偶氮唑藍(methy1thiazoly1tetrazolium，MTT)比色法測定細胞光密度值（opticaldensity,OD），計算出生長抑制率。研究赫賽汀、雷帕霉素單藥及聯(lián)合對NCI-N87細胞

3、增殖的影響。
　　 4.采用流式細胞術檢測赫賽汀、雷帕霉素單藥及聯(lián)合對NCI-N87細胞周期分布、凋亡及Her2蛋白表達的影響。
　　 5.采用Westernblot檢測赫賽汀、雷帕霉素單藥及聯(lián)合對NCI-N87細胞中P-Akt、P-mTOR、P-4E-BP1表達的影響。
　　 結果:
　　 1.人胃癌細胞NCI-N87中Her2蛋白高表達，而SGC-7901中Her2蛋白未見明顯表達。
　　 2

4、.不同濃度的赫賽汀對Her2陽性人胃癌細胞NCI-N87無論作用24小時、48小時還是72小時均未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞生長抑制作用。不同濃度雷帕霉素（0.1nmol/l、1nmol/l、10nmol/l、50nmol/l、100nmol/l）作用于NCI-N87細胞24小時后抑制率分別為7.77±1.12％、14.83±1.38％、25.03±1.79％、24.83±2.94％、24.03±2.38％;48小時后抑制率分別為15.90±1.6

5、6％、25.73±1.67％、32.70±1.75％、33.06±1.36％、32.97±2.15％;72小時后抑制率分別為22.83±1.33％、35.53±2.65％、45.23±2.01％、44.03±3.35％、44.27±2.31％?？梢钥闯霾煌瑵舛鹊睦着撩顾刈饔糜贜CI-N87細胞24小時、48小時和72小時后均可抑制細胞的增殖。在一定濃度范圍內(0-10nmol/l)，隨雷帕霉素濃度的增加，抑制作用逐漸增強，且隨著雷帕霉素

6、作用時間的延長，抑制作用也逐漸加強，各濃度組間存在統(tǒng)計學差異(P＜0.01)，與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。說明在一定濃度范圍內雷帕霉素對NCI-N87細胞的抑制作用呈時間-劑量依賴關系;雷帕霉素濃度為10nmol/l、50nmol/l和100nmol/l時，對NCI-N87細胞的抑制率差異有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。赫賽汀聯(lián)合雷帕霉素作用于NCI-N87細胞48小時后抑制率為57.78±2.75％，與單藥組相比

7、，對NCI-N87細胞的增殖抑制作用有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。根據(jù)金氏公式檢驗得知，q值等于1.72＞1.15，赫賽汀聯(lián)合雷帕霉素具有協(xié)同作用。
　　 3.赫賽汀（100ug/ml）、雷帕霉素（10nmol/l）單藥及聯(lián)合作用于NCI-N87細胞48小時后，G1期細胞百分數(shù)依次為49.87±1.14％、59.60±1.05％、72.83±0.87％;S期依次為34.27±0.67％、23.63±1.11％、11.6±1.

8、25％;G2期依次為15.86±1.29％、16.77±1.06％、15.53±0.42％，對照組G1期細胞百分數(shù)為43.03±0.68％，S期為41.60±0.82％，G2期為15.37±0.42％，可見G1期細胞百分比明顯上升，S期細胞百分比明顯減少，使細胞阻滯于G1期，與對照組相比具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01);G2細胞百分比變化不明顯，與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05）;聯(lián)合用藥組與單藥組相比，G1期細胞百分比明顯上升

9、，S期細胞百分比明顯減少，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 4.赫賽汀（100ug/ml）、雷帕霉素(10nmol/l)單藥及聯(lián)合用藥作用于NCI-N87細胞48小時后凋亡率分別為3.38±0.45％、7.71±1.44％、33.71±2.05％，對照組為0.73±0.06％。赫賽汀單藥對NCI-N87細胞無明顯誘導凋亡作用，與對照組相比，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);其他實驗組與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P

10、＜0.01）;聯(lián)合組與單藥組相比，具有顯著統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。
　　 5.赫賽?。?00ug/ml）、雷帕霉素（10nmol/l）單藥及聯(lián)合作用于NCI-N87細胞48小時后，F(xiàn)CM檢測Her2蛋白表達的FI值分別為0.632±0.004、0.870±0.021、0.506±0.015;Westernblot法檢測P-Akt、P-mTOR、P-4E-BP1蛋白的表達量分別為0.430±0.045、0.623±0.031、

11、0.110±0.046;0.570±0.053、0.320±0.046、0.120±0.026;0.387±0.086、0.370±0.662、0.117±0.050;對照組分別為0.943±0.042、0.887±0.025、0.683±0.031，提示赫賽汀、雷帕霉素單藥或聯(lián)合用藥均可可下調Her2蛋白、P-Akt、P-mTOR、P-4E-BP1的表達，與對照組相比具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01);聯(lián)合用藥組與單藥組相比，差異具有統(tǒng)計

12、學意義(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 1.赫賽汀單用對Her2陽性的人胃癌細胞NCI-N87沒有體外殺傷作用，聯(lián)合雷帕霉素后有明顯的生長抑制作用，使細胞停滯于G1期，誘導人胃癌細胞NCI-N87凋亡，兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用。
　　 2.赫賽汀聯(lián)合雷帕霉素可明顯下調入胃癌細胞NCI-N87中Her2蛋白、P-Akt、P-mTOR、P-4E-BP1的表達。
　　 3.赫賽汀聯(lián)合雷帕霉素誘導人胃癌細胞NC