維生素D受體FokⅠ多態(tài)性與良性前列腺增生合并組織學前列腺炎的關系及意義.pdf

1、研究背景:
　　 良性前列腺增生(benignprostatehyperplasia,BPH)是一種漸進性的病理過程。在過去的50年里，有關BPH的病因已有大量的研究證實，其中雄激素與其受體在前列腺增生的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，但它不是導致BPH的決定原因，也沒有一種理論能夠確定其中的因果關系。盡管人們早就發(fā)現(xiàn)在增生的前列腺組織標本中免疫細胞浸潤與炎癥反應的存在，但這一現(xiàn)象卻被大多數(shù)臨床與病理醫(yī)生所忽視，更低估了炎癥免疫過程在

2、BPH發(fā)生、發(fā)展中的關鍵作用。炎癥免疫過程在BPH病因和癥狀進展中可能起著關鍵作用。病理組織學研究發(fā)現(xiàn):前列腺免疫學改變通常先于BPH的組織學改變。在BPH的發(fā)展中，免疫炎癥和間質細胞互相作用與影響，使BPH長期存在慢性炎癥免疫應答過程。前列腺免疫學已發(fā)展成為BPH病因研究的一個新領域，人們開始思考與研究炎癥免疫與前列腺增生、進展是否存在因果關系，BPH組織中白細胞增多的原因與特征，在炎癥免疫與BPH反應過程中，BPH組織細胞、免疫細胞

3、、促炎癥細胞因子三者之間在前列腺分子免疫網絡中的調節(jié)效應與生物學功能，性激素與炎癥免疫在BPH發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，已成為前列腺免疫學研究的熱點問題。
　　 組織學前列腺炎(histologicalprostatitis)的病因目前尚不是很清楚。其主要的局限在于組織標本的獲取困難以及診斷標準的不統(tǒng)一，導致對其的研究一直未獲進展，其對前列腺組織生理功能的影響以及與各類前列腺臨床癥狀發(fā)生的相關性也缺乏進一步的研究。因此有必要對組織

4、學前列腺炎的病因學以及其對前列腺癥狀的影響進行深入的研究。目前對組織學前列腺炎標本的獲取主要來自前列腺增生患者，因此對組織學前列腺炎的研究通常兼顧對前列腺增生的研究。
　　 維生素D即1,25-(OH)2D3，在體內必須通過維生素D受體(vitaminDreceptor,VDR)發(fā)生作用。VDR是親核蛋白，屬類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員，是介導1,25-(OH)2D3發(fā)揮生物學效應的核內大分子。VDR是核受體超家族的成員

5、之一，存在于靶細胞核內。人類VDR基因位于12q13-14上，全長約78000bp，由11個外顯子和11個內含子組成。VDR分為核受體(nVDR)和膜受體(mVDR)2類。nVDR影響基因表達，控制相應蛋白質的合成，mVDR則主要參與鈣磷平衡的維持。人體幾乎所有細胞均有VDR的存在。1,25-(OH)2D3在體內具有多種生物學功能，如調控免疫應答、控制細胞增殖和分化、體內礦物質平衡等，其功能主要是通過VDR介導的。VDR具有廣泛的生物學

6、效應，包括維持體內血清鈣和磷的穩(wěn)定，調節(jié)細胞增殖、分化及免疫調節(jié)功能等。其與1,25-(OH)2D3結合，可改變VDR的轉錄效率。調節(jié)鈣磷代謝是VDR的主要功能。近年來發(fā)現(xiàn)其在對機體的免疫功能亦有重要的調節(jié)作用。VDR與多種疾病的發(fā)生有相關性，已成為近年來醫(yī)學研究的熱點。
　　 單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是人類基因組中最常見、分布最廣泛的DNA多態(tài)性類型，大約每1000bp

7、就存在一個SNP。是人類基因組中物理圖譜的理想遺傳標記，能滿足對代謝、生長和疾病相關基因的定位。被認為是繼限制性片段長度多態(tài)性和微衛(wèi)星多態(tài)性之后的第三代遺傳標記。在人類基因組中大約有300萬個SNP。SNP在群體中的發(fā)生頻率不小于1％。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換(transition)，即一種嘌呤替換成另一種嘌呤，或一種嘧啶替換成另一種嘧啶;或顛換(transversion)，即嘌呤與嘧啶之間

8、的互換所引起;也可由堿基的插入或缺失所致。轉換與顛換的比例為2:1。SNP有如下幾個特點:(1)密度高。SNP是目前為止人類基因組中分布最廣泛、數(shù)量最多的的DNA多態(tài)型，大約90％的人類遺傳變異是SNP。而STR在整個基因組中約15kb才有一個STR位點。(2)片段短。SNP基因座的片段更短，更易進行PCR擴增，并且產物的長度不到100bp，這與300～400bp的STRs相比能夠更好地適用于降解的DNA樣本。(3)遺傳穩(wěn)定性強。STR

9、在基因組中存在不穩(wěn)定和密度相對較低，SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性，可以用于群體遺傳學的研究。(4)易于高通量、自動化分析。SNP大都表現(xiàn)為二等位基因標記，在檢測時只需要通過簡單的“+/-”或“有/無”來進行基因分型，易于進行分型和確定基因頻率，有利于各實驗室基因判型的標準化和質量控制，適于快速、高通量檢測和自動化分析。SNP是目前人類基因組的一個研究熱點，在遺傳作圖、群體遺傳學、疾病預防診斷治療、癌癥等方面具有不可估量的影響。
　　

10、 已有研究結果表明在不同人群中VDR基因上存在有SNP的差異。由于存在SNP種族的差異性，從而導致不同種族人群對某些疾病有遺傳易感染性。VDR基因啟動子上存在FokⅠ位點F/f單核苷酸多態(tài)性，F(xiàn)okⅠ位點多態(tài)性造成了VDRmRNA轉錄和表達水平上的差異，進而造成VDR活性不同，而VDR活性的改變會導致其許多生理功能發(fā)生變化。其中與組織學前列腺炎有關系的功能之一為免疫調節(jié)。目前已經發(fā)現(xiàn)的VDR基因上存在的與疾病發(fā)生有關的基因多態(tài)性位點有

11、BsmⅠ、TaqⅠ、FokⅠ等酶切位點，其中FokⅠ位于啟動子上，啟動子結構的改變對因的表達會產生重要的調節(jié)作用。已有的研究發(fā)現(xiàn)VDR基因多態(tài)性與某些慢性炎癥性疾病的發(fā)生有一定關系。王振華等的研究發(fā)現(xiàn)VDR基因多態(tài)性分布差異與小兒反復呼吸道感染有一定的相關性。他們選取的是Bsm-Ⅰ多態(tài)性位點，發(fā)現(xiàn)反復呼吸道感染的患兒B等位基因頻率有增高的趨勢。張立等對124例慢性牙周炎患者和91例健康對照者分析后發(fā)現(xiàn)，VDR上的TaqⅠ位點多態(tài)性中，t

12、等位基因可提高中國漢族人群患早發(fā)性牙周炎的風險。李升等運用Meta分析對TaqⅠ基因多態(tài)性與慢性牙周炎易感性進行了研究，發(fā)現(xiàn)388名慢性牙周炎患者和355名對照者中TaqⅠ基因多態(tài)性與慢性牙周炎的易感性無關。因此，VDR基因多態(tài)性與非感染性炎癥性疾病的關系值得進一步研究。
　　 在分析和研究SNP的諸多方法中，通過聚合酶鏈反應—限制性片斷長度多態(tài)性方式(polymerasechinareaction-restrictionfra

13、gmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)為目前運用較多且十分成熟的方法。其基本原理為:首先利用DNA提取技術分離和純化目的基因片段，然后運用PCR技術對目的基因片段進行特異性擴增，再利用針對特殊酶切位點的生物酶進行目的基因片段的酶切，最后對酶切后的片段進行電泳，判讀其基因型。其中PCR技術經過多年的發(fā)展，已經成為研究基因組學相當成熟的實驗平臺，用于擴增目的基因。而RFLP技術也在不斷進步和發(fā)展，為SNP相關研究

14、提供了有力的技術支持。
　　 目的和意義:
　　 1.本研究通過PCR-RFLP方法檢測前列腺增生合并組織學前列腺炎和單純良性前列腺增生患者VDR基因啟動子上存在的FokⅠ位點SNP基因型，分析VDR基因啟動子上存在的FokⅠ位點SNP不同的基因型與前列腺增生合并組織學前列腺炎發(fā)生之間的相關性。探討組織學前列腺炎的發(fā)生有無遺傳易感性，尋找組織學前列腺炎的遺傳性病因。
　　 2.探討VDR基因啟動子上存在的FokⅠ

15、位點SNP是否為組織學前列腺炎發(fā)生的風險因素之一，為指導組織學前列腺炎的一級預防提供依據(jù)。
　　 3.通過分析VDR基因啟動子上存在的FokⅠ位點SNP與組織學前列腺炎嚴重程度分型之間的關系，為指導組織學前列腺炎的病理診斷分型以及指導臨床治療提供一定的參考。
　　 4.通過基因測序方法檢驗PCR-RFLP方法分析SNP基因的準確性和可重復性。為開展SNP的分析提供實驗指導。
　　 方法:
　　 收集200

16、8年8月至2011年11月在廣州市紅十字會醫(yī)院泌尿外科治療的前列腺增生合并組織學前列腺炎患者169例（炎癥組），術后組織病理檢查示前列腺增生，慢性前列腺炎，平均年齡73.9±2.7歲。同時收集156例單純前列腺增生患者（對照組），病理檢查示前列腺增生，平均年齡73.56±2.68歲。兩組患者標本均為行經尿道前列腺電切(TURP)術后獲得。取得標本后，常規(guī)行10％的中性福爾馬林浸泡。行常規(guī)病理組織學檢查。并收集兩組患者相關基本臨床資料，P

17、SA，IPSS評分，前列腺體積，尿流率以及前列腺增生藥物治療情況等。
　　 通過聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性（Polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）檢測研究對象VDR基因啟動子上存在的FokⅠ位點SNP基因型:1.從NCBI的genebank中檢索VDR基因的相關資料，獲得其基因序列，2.采用Genefisher軟件設計

18、PCR引物，3.利用TIANampGenomicDNAKit試劑盒提取目的基因DNA片段，4.在PCR儀上進行目的基因的擴增，5.鑒定擴增后的目的基因片段，6.對擴增后目的基因片段進行特異性酶切，7.收集酶切后的片段進行瓊脂糖凝膠電泳，8.對電泳結果進行判讀。9.通過基因測序方法對酶切結果進行分析，評估PCR-RFLP的準確性。
　　 運用常規(guī)病理方法檢查單純良性前列腺增生以及前列腺增生合并組織學前列腺炎的發(fā)生情況，并對組織學前

19、列腺炎的嚴重程度進行分型，以此為依據(jù)進行研究對象的分組。
　　 統(tǒng)計學處理:
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。良性前列腺增生合并組織學前列腺炎和單純前列腺增生患者的年齡，PSA，IPSS評分，前列腺體積，尿流率等相關臨床資料對比采用t檢驗。根據(jù)Hardy-weinberg定律，采用直接計算法計算兩組基因型和等位基因頻率的實際數(shù)和預期數(shù)，了解各基因型在人群中遺傳平衡的符合程度，采用x2檢驗。比較兩組基因型以

20、及等位基因頻率的差異性，采用x2檢驗。兩兩比較用分割的x2檢驗。比較不同嚴重程度的組織學前列腺炎之間基因型以及等位基因頻率的差異性，采用x2檢驗。采用多元Logistic回歸法分析VDR基因啟動子上存在的FokⅠ位點SNP不同的基因型與BPH合并組織學前列腺炎發(fā)生風險之間的關系。通過逐步回歸對控制年齡等因素后的風險進行評估。P＜0.05說明差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01說明差異有顯著統(tǒng)計學意義。
　　 研究內容和過程:
　

21、　 1.本研究采用病例對照研究方法，制定良性前列腺增生合并組織學前列腺炎以及單純前列腺增生的納入以及排除標準，選定研究對象，2.用TIANampGenomicDNAKit試劑盒（深圳晶美公司提供）提取169例前列腺增生合并組織學前列腺炎患者以及156例單純前列腺增生的目的基因片段，3.運用PCR方法擴增目的基因片段，4.通過RFLP方法分析研究對象VDR基因啟動子FokⅠ位點SNP基因型，5.通過基因測序方法對酶切結果進行分析，評估P

22、CR-RFLP實驗的準確性，6.運用常規(guī)病理檢查方法確診單純良性前列腺增生以及前列腺增生合并組織學前列腺炎，同時對組織學前列腺炎的嚴重程度進行分類，7.通過直接計算以及統(tǒng)計學方法進行兩組研究對象的Hardy-weinberg平衡檢驗，分析觀察對象的群體代表性，8.通過統(tǒng)計學軟件分析兩組觀察對象基本臨床資料差異性有無統(tǒng)計學意義，9.運用統(tǒng)計學方法分析VDR基因啟動子FokⅠ位點SNP與BPH合并組織學前列腺炎之間的相關性，并分析該SNP與

23、組織學前列腺炎嚴重程度之間的相關性，10.運用單因素回歸分析法，分析VDR基因啟動子上存在的FokⅠ位點SNP是否為組織學前列腺炎發(fā)生的風險因素。
　　 結果:
　　 1.對良性前列腺增生合并組織學前列腺炎以及單純前列腺增生患者VDR基因FokⅠ位點SNP基因型分布的實際數(shù)和預期數(shù)進行直接計算，再通過x2檢驗，結果顯示實際數(shù)與預期數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05），符合Hardy-Weinberg定律，在遺傳學上說明該人

24、群資料具有代表性。
　　 2.對兩組患者的相關臨床資料進行比較用t檢驗。結果顯示兩組患者平均年齡無顯著差異(P=0.118)，炎癥組PSA水平(ng/ml)顯著高于對照組(P=0.001);兩組患者術前血常規(guī)以及尿常規(guī)檢查未見感染，肝，腎功能檢查未見異常。國際前列腺癥狀(I-PSS)評分:炎癥組為15.4±2.5分，對照組為15.3±2.32分，兩組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.744)。兩組患者術前行經腹部B超測量前列腺體積

25、，用左右、前后、上下三組徑線(毫米，mm)表示，炎癥組前列腺體積(毫升，ml)=0.52×（前列腺三徑的乘積）顯著大于對照組(P=0.027)，術后前列腺切除重量（克，g）無統(tǒng)計學意義(P=0.423)炎癥組有35例術前無急性尿潴留，常規(guī)行尿流率檢查，對照組有40例行尿流率(ml/s)檢查，兩組其余患者均已停留尿管，兩組間已行的尿流率的差異無統(tǒng)計學意義（P=0.626）。
　　 3.對兩組患者VDR基因啟動子FokⅠ位點SNP基

26、因型進行比較，采用x2檢驗。結果顯示ff基因型在炎癥組為37％(62/169)，對照組為25％(39/156)，該基因型在兩組間的分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而FF和Ff基因型在兩組之間的分布為:炎癥組:25％(43/169);對照組:35％(55/156)和38％(64/169);40％(62/156)，差異無統(tǒng)計學顯著性意義(P＞0.05)。F基因頻率在炎癥組為44％(150/338)，對照組為55％(172/312)，f

27、基因頻率在炎癥組為56％(188/338)，對照組為:45％(140/312)，兩組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.本研究所選人群中重度組織學前列腺炎三種基因型的分布不符合Hardy-Weinberg定律，故該類型在本研究中不具有人群代表性。而輕度以及中度組織學前列腺炎三種基因型的分布符合Hardy-Weinberg定律。故分析三種基因型在輕度和中度組織學前列腺炎之間的差異性。結果顯示FF、Ff以及ff基因型

28、在輕度炎癥組與中度炎癥之間的分布為:32％(25/79)，23％(12/52);46％(36/79)，40％(21/52);22％(18/79)，37％(19/52)，差異無統(tǒng)計學顯著性意義(P＞0.05）。F基因頻率在輕度炎癥組和中度炎癥組分別為54％(86/158)，43％(45/104)，f基因頻率在兩組的分別為46％(72/158)，57％(59/104)，兩組之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　 5.通過基因

29、測序方法對PCR-RFLP的實驗結果進行分析，隨機抽取三種基因型各10例進行基因測序，發(fā)現(xiàn)基因型符合實驗前的基因排列。驗證了PCR-RFLP實驗的準確性和可重復性。
　　 6.以VDR基因啟動子FokⅠ位點F/f單核苷酸多態(tài)性的基因型為自變量，以BPH合并組織學前列腺炎作為因變量，進行BPH合并組織學前列腺炎危險因素Logistic回歸分析。結果顯示，在控制了年齡等因素后，F(xiàn)okⅠ多態(tài)性是前列腺增生合并組織學前列腺炎發(fā)生的風險因

30、素(P＜0.05)。其中ff基因型相對于FF基因型的OR值為2.03(0.279～0.866)其中Ff基因型相對于FF基因型的OR值為1.32(0.446～1.287)，其中ff基因型相對于Ff基因型的OR值為1.54(0.382～1.105)。
　　 結論
　　 1.VDR基因啟動子FokⅠ位點SNP中ff基因型以及f基因等位頻率在前列腺增生合并組織學前列腺炎和單純前列腺增生患者中的分布差異有統(tǒng)計學意義，說明ff基因型

31、與組織學前列腺炎的發(fā)生有相關性。VDR基因啟動子FokⅠ位點SNP作為一種遺傳標記，說明組織學前列腺炎的發(fā)生有人群遺傳易感性。從而為組織學前列腺炎的病理分型以及臨床治療提供一定的指導。
　　 2.通過單因素Logistic回歸分析VDR基因啟動子FokⅠ位點SNP與前列腺增生合并組織學前列腺炎發(fā)生之間的關系，發(fā)現(xiàn)VDR基因啟動子FokⅠ位點SNP是組織學前列腺炎發(fā)生的獨立危險因素。為從基因水平治療組織學前列腺炎提供參考。