中國(guó)美利奴細(xì)毛羊BAC文庫(kù)的混合及篩選.pdf

1、目的：本研究旨在將中國(guó)美利奴細(xì)毛羊基因組BAC文庫(kù)分兩級(jí)構(gòu)建高質(zhì)量的三維結(jié)構(gòu)混合池,同時(shí)設(shè)計(jì)一種高通量快速PCR篩選兩級(jí)混合池的方法,為后續(xù)研究者從7.4萬(wàn)個(gè)克隆中快速篩選陽(yáng)性克隆,以用于綿羊基因組物理圖譜的繪制和基因的圖位克隆等研究,為其提供作圖“試劑”和克隆材料。 方法：用等級(jí)混合法構(gòu)建中國(guó)美利奴細(xì)毛羊基因組BAC文庫(kù)的三維一級(jí)混合池和二級(jí)混合池,一級(jí)混合池基于每4個(gè)384-well盤(pán)而構(gòu)建,由相同的行、列分別構(gòu)建行列的一級(jí)

2、混合池,每盤(pán)各構(gòu)建一個(gè)盤(pán)的一級(jí)混合池；將構(gòu)建好的盤(pán)一級(jí)混合池(168個(gè))以12列×1 4行的方式排列,每行(或列)各構(gòu)建盤(pán)的二級(jí)混合池,將行(或列)標(biāo)號(hào)相同的一級(jí)混合池分別混合成一個(gè)行(或列)的二級(jí)混合池。本研究中采用PCR方法篩選,采用一步篩選一個(gè)克隆或三步篩選多個(gè)克隆的策略。第一步篩選盤(pán)、行和列的二級(jí)混合池,此時(shí)可以直接確定一個(gè)陽(yáng)性克隆,如果陽(yáng)性克隆在兩個(gè)以上,需采用三步篩選法,即陽(yáng)性盤(pán)的確定和陽(yáng)性盤(pán)中的陽(yáng)性行、列的確定。

3、結(jié)果：共構(gòu)建以一級(jí)盤(pán)混合池168個(gè),一級(jí)行混合池672個(gè),一級(jí)列混合池1008個(gè)；二級(jí)盤(pán)混合池26個(gè)(12+1.4),二級(jí)行混合池16個(gè),二級(jí)列混合池24個(gè)。用綿羊基因組分子標(biāo)記BF94-1為引物,用一步共66個(gè)PCR反應(yīng)成功篩選到一個(gè)陽(yáng)性克隆。 結(jié)論：本研究所構(gòu)建的混合池至少可滿足300次PCR篩選所需。用本研究中設(shè)計(jì)的一步或三步篩選策略可高效快速的篩選出大量陽(yáng)性克隆,進(jìn)而為綿羊基因組物理圖譜的繪制和基因的圖位克隆等研究供作圖