HBV感染DC功能障礙及HBsAg對其的免疫刺激作用.pdf

1、目的本課題通過淋巴細胞分離液實現(xiàn)體外分離人外周血樹突狀細胞并利用輔以細胞因子的無血清培養(yǎng)基AIM-V體外培養(yǎng)樹突狀細胞。并以HBV病毒蛋白組分HBsAg誘導刺激樹突狀細胞，使其產生針對HBV特異性的細胞免疫作用。通過ELISA、MTT、免疫組化等方法檢測DC的免疫功能狀態(tài)。并采用穩(wěn)定分泌HBV病毒抗原的2．2．15細胞株與DC混合培養(yǎng)來觀察經重組HBsAg誘導的DC對2．2．15細胞的生長代謝抑制作用，從而探討HBsAg作為免疫誘導劑改

2、善DC功能，治療HBV慢性感染的作用，尋求慢性HBV感染治療的新思路。方法收集慢性乙型肝炎患者30例及正常對照20例之外周血，淋巴細胞分離液分離病人和正常對照者外周血單個核細胞。并分為重組HBsAg處理組(A組)、乙肝組(B組)、正常對照組(C組)三組。以無血清培養(yǎng)基AIM-V(添加細胞因子IFN-ot、GM-CSF、IL-4)體外培養(yǎng)并分離出DC。通過光鏡、瑞氏染色、電鏡鑒定DC形態(tài)，流式細胞檢測DC表面CD80／CD86表達、免疫組

3、化檢測DC表面HLA-DR的表達、ELISA檢測DC分泌IL．12情況、混合淋巴細胞試驗(MLR)檢測DC刺激同種異體淋巴細胞增殖作用。在A組DC培養(yǎng)過程中加入不同濃度重組HBsAg(O、5、10、25、40[tg／m1)刺激誘導(分別為Al、A2、A3、A4組)，并通過MLR檢測DC刺激同種異體淋巴細胞增殖作用，以ELISA檢測DC分泌細胞因子IL—12的變化情況。將不同濃度誘導后的DC與2．2．15細胞混合培養(yǎng)，分別收集24h、48

4、h、72h培養(yǎng)的上清，ELISA測定培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的表達情況。 結果1、光鏡、瑞氏染色、電鏡、CD80／CD86表達情況、HLA-DR表達情況及培養(yǎng)上清中IL一12水平從形態(tài)學、細胞表面分子的表達和功能三方面檢測證實本實驗成功體外分離培養(yǎng)出較高純度人外周血DC。2、B組IL．12分泌水平及MLR同種異體淋巴細胞生長刺激指數明顯低于C組(P<0．05)。A3、A4組IL-12分泌水平及MLR同種異體淋巴細胞生長刺

5、激指數明顯高于B組(P<0．05)，A4組與C組沒有顯著性差異(P>0．05)。IL．12分泌水平及對同種異體淋巴細胞生長刺激指數均存在明顯劑量一效果依賴關系(相關指數O＜r<1)。3、B組與2．2．15混合培養(yǎng)上清HBeAg抑制率明顯低于C組及A4組(P<0．05)，A組HBeAg抑制率隨重組HBsAg處理濃度增加呈現(xiàn)上升趨勢。各組對HBsAg分泌的抑制率沒有顯著性差異(P>0．05)。 結論慢性乙肝患者外周血DC存在功能障礙