MAGE-A3基因沉默對肝癌化療藥物敏感性的影響及凋亡機制的初步研究.pdf

1、【背景與目的】
　　肝細胞癌（hepatocellsular carcinoma，HCC))是一種惡性程度高、預后差的常見腫瘤。治療早期肝癌最為有效的方式是手術(shù)切除，但藥物的化療仍是中晚期肝癌患者重要的輔助治療手段。黑色素瘤抗原(melanoma antigen gene，MAGE）在正常組織中僅表達于睪丸和胎盤中，而在各種腫瘤組織中高表達，與惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、復發(fā)、預后及耐藥相關(guān)?；瘜W合成MAGE-A3 siRNA小干擾片段

2、，轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2及Huh-7，加入化療藥物處理，觀察MAGE-A3沉默后對人肝癌細胞株 HepG2、Huh-7化療藥物敏感性的影響，并初步闡明相關(guān)的分子機制，探討MAGE-A3基因在人肝細胞癌化療藥物治療過程中所起的作用，為臨床尋找提高肝癌化療藥物敏感性的方法奠定基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　1.培養(yǎng)表達MAGE-A3的人肝癌細胞株HepG2（P53野生型）和Huh-7（P53突變型），化療藥順鉑（Cisplatin

3、,DDP）和阿霉素（Adriamycin,ADM）處理后，實驗觀察細胞生長情況，采用Q-PCR和Western Blot檢測加藥前后兩種細胞中MAGE-A3 mRNA和MAGE-A3蛋白的表達情況。
　　2.針對MAGE-A3 mRNA體外化學合成siRNA，采用RNAi-Mate瞬時轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HepG2，Huh-7細胞，實驗分空轉(zhuǎn)組（僅加轉(zhuǎn)染試劑）、陰性對照組（加不相關(guān)小RNA）和MAGE-A3 siRNA干擾組（干擾組），倒置

4、熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，用Q-PCR和Western Blot檢測轉(zhuǎn)染后肝癌細胞MAGE-A3 mRNA和MAGE-A3蛋白的表達情況。
　　3.在MAGE-A3基因沉默的肝癌細胞中加入不同濃度的化療藥，MTT實驗檢測細胞生長抑制情況，計算半數(shù)抑制濃度(inhibitory concentration50，IC50)，比較MAGE-A3 siRNA轉(zhuǎn)染前后肝癌細胞對化療藥物敏感性的變化，觀察其變化是否通過MAGE-A3表達下調(diào)起作

5、用。
　　4.流式細胞儀檢測化療藥物作用前后肝癌細胞凋亡情況和細胞周期的改變，了解MAGE-A3基因沉默后肝癌細胞凋亡及細胞周期的變化。
　　5.MAGE-A3基因沉默前后，Q-PCR和Western Blot技術(shù)比較化療藥物處理的肝癌細胞中P53、Bcl-2、Bax、survivin、caspase3和caspase9基因的表達情況。
　　【結(jié)果】
　　1. HepG2、Huh-7細胞表達MAGE-A3，加入D

6、DP和ADM處理后，HepG2、Huh-7細胞MAGE-A3的表達隨著藥物劑量的增加和作用時間的延長而增強。
　　2.MAGE-A3 siRNA664片段轉(zhuǎn)染HepG2、Huh-7細胞24h、48h、72h，Q-PCR檢測結(jié)果顯示MAGE-A3基因的表達受到顯著抑制，以轉(zhuǎn)染后48h效果最佳，沉默效率達70％以上。Western Blot檢測也證實該片段轉(zhuǎn)染48h后兩株細胞的MAGEA3蛋白表達水平顯著下降。
　　3.MTT檢

7、測結(jié)果顯示：DDP、ADM分別作用于HepG2、Huh-7細胞24h、48h、72h后，細胞的生長受到抑制，顯示劑量依賴性和時間依賴性。轉(zhuǎn)染MAGE-A3 siRNA后，HepG2細胞對DDP、ADM的敏感性分別提高1.57倍、2.15倍，差別有顯著意義（P<0.05），而 Huh-7細胞對 DDP、ADM的敏感性分別提高1.22倍、1.21倍，統(tǒng)計學分析有差異（P<0.05）。
　　4.Annexin V檢測HepG2、Huh-

8、7細胞凋亡，結(jié)果顯示：在不加化療藥物處理的情況下，HepG2細胞干擾組細胞凋亡率顯著增加，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而 Huh-7細胞干擾組與對照組相比，統(tǒng)計學分析無明顯差異(P>0.05)。加入DDP、ADM處理后，HepG2、 Huh-7細胞干擾組的細胞凋亡率均明顯高于對照組，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示沉默MAGE-A3能夠增強DDP、ADM對HepG2、Huh-7細胞的細胞毒性作用，以HepG2細胞為顯著。

9、r>　　5.碘化丙啶(Prodium Iodide，PI)檢測HepG2、Huh-7細胞周期，結(jié)果顯示：MAGE--A3沉默后，兩株細胞易阻滯于G2期；加入DDP處理，干擾組與對照組比較，HepG2、Huh-7細胞易阻滯于S期，加入ADM處理，干擾組與對照組比較，HepG2、Huh-7細胞易阻滯于G2期。
　　6.Q-PCR和Western Blot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)因子，結(jié)果顯示：下調(diào) MAGE-A3后，加入DDP、ADM處理，H

10、epG2細胞中P53、Bax、caspase3、caspase9表達增加，而Bcl-2、survivin表達下降，提示MAGE-A3沉默增強HepG2細胞化療藥物細胞毒作用的可能機制是誘導 P53依賴的細胞凋亡通路；而 Huh-7細胞中突變型P53表達下降同時伴有Bax表達增加及survivin表達下降，但與Bcl-2、caspase3、caspase9的變化無相關(guān)性。提示MAGE-A3沉默影響Huh-7細胞化療藥物細胞毒作用可能涉及非