噬菌體展示技術經鼻篩選腦靶向肽.pdf

1、目的：利用噬菌體肽庫展示技術篩選能夠與大腦特異性結合的特異性噬菌體，選擇幾個代表性的單克隆進行測序，最后合成一條最有特異性的單克隆噬菌體所展示的短肽，并進一步探討合成短肽的腦靶向性以及繞過血腦屏障到達大腦的可能途徑。 方法：使用含有7個氨基酸的Ph.D.-C7C噬菌體展示肽文庫，進行三輪高通量的體內生物篩選步驟。進行每一輪篩選時，噬菌體從鼻腔給予，45分鐘后，分離大鼠大腦組織，俘獲腦組織中的噬菌體，進行滴度測定。經過三輪富集后，

2、挑取十個陽性單克隆噬菌體進行測序，并選擇其中一個最富代表性的噬菌體，合成其所展示的短肽。然后通過序列特異性比較實驗、競爭結合抑制實驗、免疫組化和免疫熒光實驗驗證該克隆噬菌體及其攜帶的短肽的腦靶向性。 結果：經過三輪篩選后，大腦中的噬菌體逐漸富集。7號單克隆噬菌體與C7C庫噬菌體、隨機噬菌體分別鼻腔給予后，腦組織中的噬菌體數(shù)量總體上存在明顯差異(P<0.01)；7號單克隆噬菌體鼻腔給予后，大腦分別與血液、脾臟、肝臟之間比較，都有顯

3、著性差異(P’s<0.01)；不同量的NB-101肽(naso-brain-101peptide，即7號單克隆噬菌體所展示的短肽)和對照肽分別與7號單克隆噬菌體同時鼻腔給予后，前者大腦中的噬菌體數(shù)量明顯少于后者(P<0.01)；7號單克隆噬菌體鼻腔給予后，分別取大腦與脾臟、肝臟進行免疫熒光組化，結果發(fā)現(xiàn)大腦中可見很多紅色熒光點(陽性)，而肝臟和脾臟中都陰性；FITC-NB-101肽與對照肽(FITC-TD-1)分別鼻腔給予后，分離嗅神經

4、，固定、脫水、切片后在熒光顯微鏡下不同時間點(1秒、3秒、5秒及7秒)曝光，發(fā)現(xiàn)FITC-NB-101肽的熒光明顯強于對照組。 結論：通過鼻腔給予噬菌體，經過三輪的篩選，噬菌體得到了明顯的富集，得到了特異性最強的單克隆噬菌體(與大腦表面特異性結合)—即7號單克隆噬菌體，序列上和組織上都存在特異性。7號單克隆噬菌體所展示的短肽(NB-101肽)人工合成后，具有一定的腦靶向性，可以競爭性抑制噬菌體進入大腦組織。并且在嗅神經中大量富集