共表達(dá)AIV HA（H5）和NDV HN或NDV F和HN的兩種重組雞痘病毒的構(gòu)建與免疫效力.pdf

1、新城疫、高致病性禽流感是嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展及公共安全的的二種重要傳染病，免疫接種是預(yù)防這兩種傳染病的主要措施。為克服常規(guī)疫苗的不足，研制新一代安全高效、使用方便的基因工程疫苗，我們利用新型轉(zhuǎn)移載體pP12LS，分別構(gòu)建了共表達(dá)．AIV H5A和NDV HN基因及共表達(dá)NDV F和HN基因的兩種重組雞痘病毒，并對其免疫效力進(jìn)行評估，主要內(nèi)容如下： 1.表達(dá)NDV F基因和H5亞型AIV HA基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建首先將轉(zhuǎn)移載

2、體pPE/LNA用Sma I+Not I進(jìn)行雙酶切，回收包含啟動子PE/L的載體片段pPE/L，；同時將質(zhì)粒pTH5Am用Sma I+Not I進(jìn)行雙酶切，回收HAm基因片段，將HAm片段和載體片段pPE/L連接，得中間轉(zhuǎn)移載體pPE/LHAm。將pPE/LHAm用HindⅢ酶切，回收約1.8Kb的含有PE/L啟動子的HAm片段，與經(jīng)HindⅢ酶切回收的線性載體pPl2LSHN進(jìn)行連接，得到H5A和HN基因的啟動子分別為PE/L和Ps，

3、且兩基因盒方向?yàn)楸诚虼?lián)的重組轉(zhuǎn)移載體pP13LSH5AHN。將pPl2LSHAHN轉(zhuǎn)染至已預(yù)先感染雞痘病毒大空斑株(LP-FPV)的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中，pPl2LSHAHN與LP-FPV基因組DNA之間的同源重組產(chǎn)生了重組雞痘病毒rFPV-12LSHAHN，通過在含X．Gal的營養(yǎng)瓊脂上連續(xù)挑選藍(lán)色病毒蝕斑，獲得純化的重組病毒，間接熒光試驗(yàn)結(jié)果表明HA和HN在細(xì)胞中均得到很好表達(dá)。經(jīng)傳代證實(shí)該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性，與親

4、本毒相比，重組病毒在病毒的復(fù)制和致雞胚成纖維細(xì)胞的病變方面無顯著不同，生長速度也未發(fā)生顯著改變。 2.表達(dá)NDVF基因和HN基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建將近年來鵝源新城疫流行強(qiáng)毒株ZJ1的F和FIN基因插入新型轉(zhuǎn)移載體pP12LS中。F和HN基因的啟動子分別為PE/L和Ps，獲得用不同的啟動子啟動不同的外源基因且兩基因盒方向?yàn)楸诚虼?lián)的轉(zhuǎn)移載體pPl2LSFHN，通過和親本病毒LP-FPV基因組DNA之間的同源重組獲得了重組雞痘病毒

5、rFPV-12LSFHN：通過藍(lán)斑篩選獲得純化病毒，間接熒光試驗(yàn)結(jié)果表明F和HN在細(xì)胞中均得到很好表達(dá)。與親本病毒相比，重組病毒的空斑形成明顯的合胞體，之前未見報道。而單表達(dá)新城疫病毒F基因的重組病毒rFPV-12LSF和單表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組病毒ffPV-12LSHN都未出現(xiàn)感染細(xì)胞發(fā)生融合的特征，可能是由于rFPV-12LSFHN中F和HN蛋白同時并準(zhǔn)確表達(dá)造成的，也可能和ZJ1株新城疫病毒F蛋白的強(qiáng)融合能力有關(guān)。此外，重組

6、病毒的生長速率有較顯著提高，并且能夠達(dá)到比親本病毒更高的病毒滴度，可能是由于融合作用加速了對鄰近細(xì)胞的感染進(jìn)程，此特性為疫苗生產(chǎn)提供了有利條件。同時，本實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明了F蛋白的融合作用必須有HN的協(xié)助才能完成。 3.rFPV-12LSHAHN和rFPV-12LSFHN的免疫效力檢測。 3.1 ffPV-12LSHAHN和ffPV-12LSFHN在SPF雞上的免疫效力檢測。 3.1.1 SPF雞免疫ffPV-12

7、LSHAHN后抵抗SY株AIV攻擊的免疫保護(hù)作用將1日齡SPF雞隨機(jī)分為3組，8只/組，隔離飼養(yǎng)。于14日齡分別于頸部皮下接種重組病毒rFPV-12L,SHAHN、LP-FPV，2×104PFU/只，同時設(shè)H5 AIV油苗對照組，頸部皮下接種，0.2mL/只。免疫后21d，使用SY株H5 AIV，通過滴鼻點(diǎn)眼途徑，以5×104 ELD50/羽的劑量對各組雞進(jìn)行攻毒。攻毒后連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計發(fā)病死亡情況，并于攻毒后第4天和第14天采集試

8、驗(yàn)雞的氣管和泄殖腔棉拭子，接種10日齡SPF雞胚作病毒分離試驗(yàn)。結(jié)果表明除LP-FPV組全部死亡外，其余各組均能完全抵抗SYH5 AIV的攻擊；rFPV-12LSHAHN與H5 AIV油苗免疫組在排毒方面也無顯著差別。 所有試驗(yàn)雞分別在免疫后7d、14d、21d采血，分離血清，用HI試驗(yàn)測定血清中的抗體效價。 3.1.2 SPF雞免疫rfPV-12LSHAHN或rFPV-12LSFHN后抵抗F48E8株NDV攻擊的免疫保

9、護(hù)作用將1日齡SPF雞隨機(jī)分為4組，8只/組，隔離飼養(yǎng)。10日齡時，于頸部皮下分別接種重組病毒rFPV-12LSHAHN、rFPV-12LSFHN、LP-FPV，2×104PFU/只，同時設(shè)ZJ1株NDV油苗對照組，頸部皮下接種，0.2mL/只。免疫后21d，每只試驗(yàn)雞接種5×lO7ELD50的F48E8株NDV，攻毒后連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計發(fā)病死亡情況，并于攻毒后第5天和第10天采集試驗(yàn)雞的氣管和泄殖腔棉拭子，接種10日齡SPF雞胚作病

10、毒分離試驗(yàn)。結(jié)果表明除LP-FPV組全部死亡外，其余均能抵抗F48E8株NDV的攻擊，排毒方面也無顯著差別。 所有試驗(yàn)雞分別在免疫后7d、14d、21d采血，分離血清，用HI試驗(yàn)測定血清中的抗體效價。 3.2商品雞免疫rFPV-12LSHAHN后抵抗SY株AIV攻擊的免疫保護(hù)作用將1日齡商品雞隨機(jī)分為3組，20只/組，隔離飼養(yǎng)。于10日齡分別于頸部皮下接種重組病毒rFPV-12LSHAHN、LP-FPV，2×105PFU

11、/只，同時設(shè)H5 AIV油苗對照組，頸部皮下接種，0.2mL/只。免疫后28d，使用SY株H5 AIV，通過滴鼻點(diǎn)眼途徑，以5x104 ELD50/羽的劑量對各組雞進(jìn)行攻毒。攻毒后連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計發(fā)病死亡情況，并于攻毒后第4天和第14天采集試驗(yàn)雞的氣管和泄殖腔棉拭子，接種lO日齡SPF雞胚作病毒分離試驗(yàn)。結(jié)果表明由于母源抗體的干擾，重組病毒在商品蛋雞體內(nèi)誘生的HI抗體效價遠(yuǎn)低于他們在SPF雞體內(nèi)誘生的HI效價，但仍能夠提供顯著水平的