深低溫冷凍保存角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文深低溫冷凍保存角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性的實(shí)驗(yàn)研究姓名：賈艷紅申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：王麗婭20070418鄭州人學(xué)2007屆碩I。研究生畢業(yè)論文渫低溫冷凍保存角膜內(nèi)皮細(xì)胞活件的實(shí)驗(yàn)研究摘舞均采用三只角膜片作為實(shí)驗(yàn)組。角膜片首先經(jīng)過冷凍預(yù)處理，然后調(diào)節(jié)程控降溫儀其中一神程序進(jìn)行冷凍降溫直至一80℃，最后放到一196℃液氮保存。氣體栓塞處死兔子后，摘除完整眼球，迅速拿至無菌室備用，沿角鞏膜緣外1～2mm將角膜全層

2、剪下，小心放于己備好的角膜瓶中，取組一液2ml加入其中，4℃冰箱浸泡10分鐘。依次在組二，組三，組四液中浸泡10分鐘，最后放于程控降溫儀中，調(diào)至其中一程序降溫直到結(jié)束后，最后將角膜瓶放入液氮中。保存一定時(shí)間后復(fù)溫，將角膜瓶從液氮中取出，迅速在40℃下復(fù)蘇融凍約1分鐘后即可取出，最后移除角膜瓶中的凍存液并再加入含有20％(FetusBloodserumFBS)的DMEM培養(yǎng)基沈脫(DimethylsulfoxideDMSO)，時(shí)間為lO分

3、鐘，最后去除沈脫液。染色固定，首先將O4％茜素紅數(shù)滴加入角膜片的內(nèi)皮面上，染色3分鐘后用生理鹽水漂洗；其次用O25％苔盼藍(lán)數(shù)滴再加入到內(nèi)皮面上染色2分鐘后，再用生理鹽水漂沈【4sl；再次用25％戊二醛2ml浸泡角膜片固定10分鐘后，再用生理鹽水漂洗。最后在顯微鏡下檢查角膜內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，以角膜片中央四個(gè)不同視野為標(biāo)準(zhǔn)，最后通過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，已a(bǔ)=O05為標(biāo)準(zhǔn)，尸(005為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果對(duì)照組即未經(jīng)過冷凍處理的新鮮兔角膜片顯微鏡檢查可

4、見內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，緊密連接，茜素紅和苔盼藍(lán)聯(lián)合染色法可見細(xì)胞呈現(xiàn)紅色的六邊形輪廓，未見到染為藍(lán)色的細(xì)胞核，細(xì)胞間隙未見增大，整個(gè)視野中可見角膜內(nèi)皮細(xì)胞大小一致形態(tài)完整。而實(shí)驗(yàn)組即經(jīng)過各種不同冷凍程序處理的角膜片經(jīng)過顯微鏡檢查可發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞間隙均有所增大，有些細(xì)胞排列仍然整齊，但細(xì)胞輪廓大多呈現(xiàn)圓形或不規(guī)則形狀，但其余很多方法凍存的細(xì)胞排列已經(jīng)不規(guī)整，形態(tài)不清，細(xì)胞邊界不存在，細(xì)胞間隙明顯增大，而且可見到許多染為藍(lán)色的細(xì)胞核，有些照片可見

5、兩三個(gè)細(xì)胞融合，有些部分細(xì)胞成片缺失，甚至可見大片融合的細(xì)胞，整個(gè)視野僅殘留裸核。經(jīng)過大量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)在第～階段降溫速度為2“C／min時(shí)和第二階段降溫速度為5℃／min時(shí)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的存活率達(dá)到最高，而其它多種方法中可見染為藍(lán)色的細(xì)胞核或者大片融合的細(xì)胞，僅殘留藍(lán)色的裸核。第一階段的降溫速度vl在一20“C／rain與其它六種速度比較，P值均O05；第二階段的降溫速度v2在一5“C／min與其它六種速度比較尸值均O05，均有統(tǒng)