microRNA-1抑制葡萄膜黑色素瘤細胞增殖與遷移的分子機制研究.pdf

1、目的:microRNAs(miRNAs)是長度約為20-24個核苷酸的內源性RNA分子,通過結合靶mRNAs的3’UTR區(qū)來抑制基因的表達。最近研究表明,miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用,然而有關miRNAs在葡萄膜黑色素瘤中的作用僅有少數(shù)相關報道。本研究旨在研究microRNA-1(miR-1)在人眼葡萄膜黑色素瘤中的功能。
　　 方法:首先,通過real-time PCR技術檢測miR-1在葡萄膜黑色素細胞

2、D78以及兩株葡萄膜黑色素瘤細胞M23與SP6.5中的表達情況。其次,用DNA甲基轉移酶抑制劑(5-Aza-2’Deoxycytidine,5-Aza)和/或組蛋白脫乙酰基酶抑制劑(Trichostatin A,TSA)兩種藥物處理M23和SP6.5后,用real-timePCR技術再檢測miR-1的表達水平。然后,通過Cy3標記的NC序列轉染M23和SP6.5,確定基因轉染技術在該類細胞中的轉染效率。并通過Northern blot檢

3、測轉染后miR-1的表達情況。再通過MTS和Transwell法在細胞水平上分別檢測轉染miR-1后M23和SP6.5的增殖和遷移能力。最后,提取轉染miR-1后M23和SP6.5中的總蛋白,在分子水平上用Western blot檢測細胞周期相關蛋白,c-Met,以及其下游與細抱增殖遷移相關的重要信號分子FAK、ERK、AKT的表達水平。
　　 結果:通過real-time PCR技術檢測miR-1的表達情況,結果顯示miR-1

4、在D78中表達較高,而在M23與SP6.5中表達明顯降低(P<0.01)。經5-Aza和/或TSA處理,M23和SP6.5中miR-1的表達水平與空白對照組(MOCK)相比明顯上調(P<0.01)。檢測陽離子脂質體介導的瞬時轉染效率,發(fā)現(xiàn)在M23和SP6.5中的轉染效率幾乎都達到了100％。通過Northern blot,結果顯示在M23和SP6.5中,只在轉染了miR-1的細胞中檢測到miR-1表達。通過MTS法檢測M23和SP6.5

5、的增殖能力,結果顯示,細胞轉染miR-1后,其增殖能力與陰性對照組(Negtive Control,NC)比明顯下降(P<0.01)。通過Transwell法檢測M23和SP6.5的遷移能力,結果顯示,細胞轉染miR-1后,其遷移能力與陰性對照組比明顯下降(P<0.01)。通過Western blot,結果顯示與陰性對照組比,在M23和SP6.5中轉染miR-1后,c-Met、p-ERK1/2、p-FAK、CDK4、p-Rb、E2F2等