檢測(cè)A群豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條的制備.pdf

1、豬輪狀病毒感染在我國(guó)和世界各養(yǎng)豬國(guó)家普遍存在?？焖贉?zhǔn)確地疾病監(jiān)測(cè)是防治該病的前提條件，雖然輪狀病毒檢測(cè)有多種方法，但適用于現(xiàn)場(chǎng)對(duì)病原作出快速檢測(cè)的方法還很有限，基于此本研究運(yùn)用膠體金免疫層析技術(shù)，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)A群豬輪狀病毒的方法。 將純化的重組PRVVP6蛋白免疫兔子，制備得到抗VP6蛋白的多克隆抗血清；用抗PRVVP6蛋白雜交瘤細(xì)胞株C5D10注射BALB/C小鼠，制備得到抗PRVVP6蛋白腹水單抗。采取辛酸

2、-硫酸銨鹽析法和蛋白A(及G)親和層析法對(duì)多克隆抗血清和腹水單抗進(jìn)行兩步純化，純化后的抗體用間接ELISA和SDS-PAGE檢測(cè)其效價(jià)和提純效果，SDS-PAGE結(jié)果顯示提純后的抗體沒(méi)有雜帶，主要為γ球蛋白，純化后的單抗與多抗同VP6蛋白ELISA效價(jià)分別為10-5和1:1200；采用檸檬酸三鈉還原法制備20nm的膠體金顆粒，膠體金標(biāo)記純化后的單抗，最佳標(biāo)記量和最適pH值的測(cè)定結(jié)果分別為60μg/ml和PH8.5，低溫超速離心法純化標(biāo)記

3、好的金標(biāo)單抗；純化后的膠體金標(biāo)記抗體作1:2.5稀釋，吸附于玻璃纖維。用純化后的多抗在硝酸纖維素膜(HF135)上劃線作為檢測(cè)線，最適劃線濃度為0.8mg/ml；用羊抗鼠IgG在硝酸纖維素膜(HF135)上劃線作為質(zhì)控線，最適劃線濃度為0.5mg/ml。檢測(cè)試紙條對(duì)PRV培養(yǎng)液和未接種病毒的細(xì)胞對(duì)照液作為已知陽(yáng)性和陰性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)時(shí)間約10min，病毒培養(yǎng)液在檢測(cè)線和質(zhì)控線出現(xiàn)兩條明顯的紅色條帶，檢驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，而細(xì)胞對(duì)照液只在質(zhì)控線

4、上出現(xiàn)紅色條帶，在檢測(cè)線未出現(xiàn)，檢驗(yàn)結(jié)果呈陰性，與預(yù)期設(shè)計(jì)的結(jié)果相一致。對(duì)試紙條進(jìn)行了敏感性、重復(fù)性、特異性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：試紙條檢出病毒培養(yǎng)液(TCID50是0.1ml10-6.25)最低限度為1:32稀釋；不同批次試紙條重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果無(wú)明顯差異；試紙條不與豬傳染性胃腸炎病毒、流行性腹瀉病毒相關(guān)腹瀉病毒發(fā)生反應(yīng)，表明所制備的試紙條具有一定的敏感性、重復(fù)性和特異性。本研究所建立的檢測(cè)抗原的膠體金免疫層析試紙條，為豬輪狀病毒病的快速診斷奠