類彈性蛋白在抗菌肽分離純化中的應(yīng)用.pdf

1、抗生素的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)由病原微生物感染而引發(fā)的各類疾病不再束手無(wú)策，在過(guò)去的半個(gè)多世紀(jì)，對(duì)人類健康作出了巨大貢獻(xiàn)。但隨著“傳統(tǒng)抗生素”的廣泛使用，同時(shí)也產(chǎn)生了很多問(wèn)題，如B-內(nèi)酰胺類抗生素的過(guò)敏反應(yīng)以及長(zhǎng)期使用導(dǎo)致抗藥菌株的產(chǎn)生?？咕?Antimicrobial polypeptides，AMPs)是兩性帶電分子，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，具有廣譜抗菌、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤等多種生物學(xué)功能，實(shí)踐表明抗菌肽不僅對(duì)耐藥性的病原細(xì)菌有很好的抑制和

2、殺滅作用，而且還對(duì)真菌、原生動(dòng)物、病毒等有很好的抑制作用，另外某些抗菌肽還可選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制HBV、HIV的復(fù)制，因而引起了科學(xué)家的很大的關(guān)注，被認(rèn)為是最有可能替代抗生素的新一代廣譜抗菌藥物。但是由于抗菌肽本身的抗菌活性和分子量等原因，目前尚未無(wú)成熟的表達(dá)純化策略，因此本文的研究目的是利用類彈性蛋白的獨(dú)特性質(zhì)來(lái)融合表達(dá)和純化抗菌肽，以期獲得表達(dá)量大且易于達(dá)到高純度的抗菌肽。研究主要從以下兩個(gè)方面來(lái)開(kāi)展：一，選用大腸桿菌偏愛(ài)密碼子

3、，根據(jù)GenBank中的基因序列，利用PCR反擴(kuò)載體的方法在pFastBac質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)引入抗菌肽Halocidin18(Hal18)基因，然后與類彈性蛋白(elastin-likepolypeptides，Elps)融合，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET23a-Hal-9Elp。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)融合蛋白H9E，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，融合蛋白得到表達(dá)(69mg/L)，同時(shí)利用類彈性的性質(zhì)對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，融合蛋白的純度達(dá)到95％，利用羥氨

4、將抗菌肽從融合蛋白上釋放出來(lái)，純化后得到1.7ml/L純度為70％左右的Hal18，管疊法測(cè)定抗菌肽抑菌活性，結(jié)果顯示出很強(qiáng)的抑制藤黃八疊球菌和大腸桿菌的活性；類彈性蛋白作為融合伴侶在大腸桿菌中成功表達(dá)和純化抗菌肽，較其他融合伴侶在表達(dá)和純化抗菌肽方面具有表達(dá)量大，純度高，易于大規(guī)模放大的優(yōu)勢(shì)。二，將抗菌肽類彈性蛋白基因，克隆至畢赤酵母分泌表達(dá)載體pHBM905，連接后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，在甲醇氧化酶(AOX)啟動(dòng)子調(diào)控下，融合蛋白