豬熱激蛋白Gp96N端基因與豬瘟病毒E2基因重組表達及重組蛋白的免疫原性研究.pdf

1、豬瘟病毒E2蛋白是豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)的囊膜糖蛋白，可誘導動物體產(chǎn)生有效的免疫保護，是研究新型疫苗的主要對象。有研究表明，Gp96N端結構區(qū)的構象有α螺旋溝，該區(qū)域與抗原肽結合能力強，形成的Gp96-抗原肽復合物非常穩(wěn)定，有潛在的免疫佐劑作用。
　　本研究將Gp96N(26AA-374AA)基因與E2全長基因通過口蹄疫病毒(Foot and MouthDisease Viru

2、s，F(xiàn)MDV)2A基因進行融合，然后分別采用真核和原核系統(tǒng)對該重組基因進行表達，并對原核表達的重組蛋白進行免疫原性的測定以探究Gp96N（26AA-374AA）蛋白與佐劑效果。
　　首先，將甲病毒復制子載體pSFV1進行改造，加入真核CMV啟動子和終止區(qū)SV40polyA序列，獲得一新的表達載體pSCA，然后將EGFP基因、豬瘟病毒E2全長基因及Gp96N端與豬瘟病E2基因的融合片段分別克隆入pSCA載體中，獲得pSCA-EGFP

3、、pSCA-E2和pSCA-GE。轉染后實驗結果表明，pSCA-EGFP質粒能夠得到有效表達，pSCA-E2、pSCA-GE能夠得到表達，但是pSCA-E2、pSCA-GE質粒表達效率不高和平均熒光值偏低。
　　其次，將E2基因與串聯(lián)重組蛋白GE基因分別克隆入原核表達載體pET-32a(+)中得到重組質粒pET-E2和pET-GE，轉化入Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，分別誘導表達獲得融合有組氨酸標簽的重組蛋白E2和GE，隨

4、后對重組蛋白表達條件進行優(yōu)化摸索最佳表達條件，并通過梯度尿素法對重組蛋白進行粗純化和復性;采用SDS-PAGE和Western Blotting實驗對目的蛋白進行檢測，結果顯示表達的重組蛋白為能與抗體特異性反應的目的蛋白。
　　最后，為了研究重組蛋白E2、GE在動物體內的免疫原性，將原核表達的重組蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗以及PBS通過皮下注射免疫小鼠。通過ELISA實驗檢測免疫鼠血清中豬瘟病毒E2蛋白的抗體水平，結果表明:重組