IBDV VP2高變區(qū)基因片段的克隆、表達及其鑒定.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是一種危害幼雞的急性、高度接觸性、病毒性傳染病。傳染性法氏囊病毒(IBDV)除引起3-6周齡易感雞發(fā)生死亡外,可致雛雞免疫抑制,導致雞群對新城疫、馬立克氏病及傳染性支氣管炎等多種主要疫病的免疫失敗。為了建立一個準確快速的診斷方法,分析我國目前使用的疫苗株的抗原基因是否發(fā)生了變異以及進一步建立能夠鑒別感染雞體內是否是由疫苗免疫所產生抗體的方法,本研究初步建立了檢測IBDV的RT-PCR方法、獲得了VP2蛋白的抗原決

2、定區(qū)域的基因,構建了該基因的重組質粒,并且成功表達了VP2基因的部分片段。 首先,根據Genbank中已登錄的傳染性法氏囊病毒VP2基因序列和在前人研究成果的基礎上,設計了含酶切位點和保護性堿基的一對引物,P1:5‘-CGGAATTCCCAAAAATGGTAGCCA-3’P2:5‘-GCGTCGACTGCCACTCTTTCGTAGG-3’,以弱毒疫苗滅菌生理鹽水稀釋液為毒種,SPF雞胚接種法增殖IBDV病毒,以尿囊液離心后的沉淀

3、物為材料,采用 Trizol試劑法提取病毒的總RNA,進行RT-PCR,擴增出大小為504bp的基因片段(記為P12),與預期的結果一致。將其插入到質粒載體PGEX-4T-1上,轉化大腸桿菌BL21,菌液PCR篩選陽性克隆和質粒PCR及雙酶切鑒定后測序。序列分析表明,P12與登錄號為DQ202329的國內毒株的同源性達99.8％以上,與國外毒株AY134874、AY598356、AF109154的同源性分別為93.5％、93.5％、94

4、.8％,這表明本實驗已成功地擴增了目的基因,為建立檢測IBDV的RT-PCR快速診斷方法奠定了基礎。 其次,根據GenBank中登錄的傳染性法氏囊病毒基因序列及原核表達質粒pGEX-4T-I的多克隆位點,設計了另兩條原核表達引物.P3:5’.CGGAATTCATGCCATTCAATCTTGTG-3’；P4:5’-GCGTCGACTGCTAGTTCAGGAATTGG-3’。為了便于基因的克隆與表達,我們在引物的5’端添加了酶切位點

5、及其保護堿基。以實驗室保存的重組質粒為模板,擴增273bp的原核表達目的片段(記為P34),將其插入到表達載體PGEX-4T-1上,轉入大腸桿菌BL21,經菌液PCR篩選陽性克隆、雙酶切鑒定后,IPTG誘導表達,經SDS-PAGE電泳檢測后,所表達的蛋白大小與預期結果一致。 綜上所述,本研究用SPF雞胚尿囊液增殖法增殖了傳染性法氏囊病毒,克隆了包括中和抗原表位在內的VP2基因高變區(qū),并且成功表達了含有一個抗原位點的VP2基因片段