豬傳染性胃腸炎病毒N基因的熒光定量PCR檢測(cè)方法建立及初步應(yīng)用.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TGE)是一種重要的仔豬病毒性腹瀉病。TGEV主要感染2周齡以內(nèi)的仔豬，引起嚴(yán)重的水樣腹瀉、嘔吐、脫水、死亡癥狀，死亡率達(dá)到100％。TGE的準(zhǔn)確診斷對(duì)防控該病非常重要。本研究以TGEVN基因?yàn)榛A(chǔ)，建立了檢測(cè)TGEV的熒光定量PCR方法，為該病的臨床診斷和疫苗含量監(jiān)控提供一種更準(zhǔn)確、靈敏的定量檢測(cè)方法。
　　本研究根據(jù)TGEV分離株（SC-H株）的N基因設(shè)計(jì)了三對(duì)引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增的目的基因片段分別為236bp

2、、186bp、236bp。擴(kuò)增目的基因與載體pMD-19(Simple)連接，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建重組質(zhì)粒。提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD-N1、pMD-N2和pMD-N3，測(cè)定三種陽(yáng)性質(zhì)粒的OD260值和OD280值，將OD260值換算成拷貝數(shù)，并進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序。將重組質(zhì)粒以10倍梯度稀釋10個(gè)梯度以制備標(biāo)準(zhǔn)品，比較了三對(duì)引物的效果，選用第二對(duì)引物對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR，建立TGEV N基因的SYBR Green-

3、Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。優(yōu)化確定了退火溫度，最佳反應(yīng)程序，TGEV實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.996，擴(kuò)增效率為101.8％。該方法特異性好，PEDV、PoRV、PRRSV、CSFV、JEV無(wú)Ct值，均為陰性;具有良好的重復(fù)性，批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)＜5％;敏感性實(shí)驗(yàn)表明，該方法可測(cè)出的最低拷貝數(shù)為6.37×101拷貝/μL（常規(guī)PCR能夠檢測(cè)出的最低拷貝數(shù)為6.37×103拷貝/μL），靈敏度比常

4、規(guī)PCR靈敏100倍。
　　將建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行了應(yīng)用評(píng)價(jià):1.臨床病料的檢測(cè):收集來(lái)自四川彭州、蒲江、茂縣、攀枝花、樂(lè)山、綿陽(yáng)、安岳、重慶涪陵、福建龍巖、山東肇東等地的臨床仔豬腹瀉病料80份，以該方法進(jìn)行檢測(cè)，并與常規(guī)PCR進(jìn)行比較，結(jié)果表明:普通PCR的結(jié)果是陽(yáng)性病料8份，利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法的結(jié)果是陽(yáng)性病料15份，常規(guī)PCR檢測(cè)出的陽(yáng)性樣品以熒光定量PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性。2.我國(guó)部分商品TGEV疫苗的病毒含量檢測(cè):用

5、該方法對(duì)基層可購(gòu)買到的幾種商品TGEV疫苗進(jìn)行了隨機(jī)抽檢，測(cè)定病毒含量，結(jié)果表明:A公司的TGEV活疫苗含量較高，分別為:11089.35、7551.55、8041.59、12752.23、8097.97、9509.51、9916.58拷貝/μL;B、C、D公司的TGEV滅活疫苗含量非常少。
　　本研究成功的建立了TGEV N基因SYBR Green-Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)TGEV進(jìn)行定性和定量測(cè)定，為該病的準(zhǔn)