猴結(jié)核分枝桿菌Ag85B基因的克隆、表位免疫原性初步研究以及猴結(jié)核快速鑒定方法的建立.pdf

1、目前結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium)仍然是嚴(yán)重危害人類健康的重要病原微生物，其每年在全球范圍內(nèi)引起超過一千萬人口的感染并導(dǎo)致約三百萬人口的死亡。隨著近年來結(jié)核分枝桿菌耐藥株的不斷出現(xiàn)以及BCG作為目前唯一用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗，存在免疫保護(hù)效果不穩(wěn)定；接種后使結(jié)核菌素試驗呈陽性，干擾結(jié)核病的診斷，延誤治療時機(jī)；免疫功能缺陷患者如艾滋病等接種后可能引起嚴(yán)重的散播性結(jié)核病等多方面的原因，發(fā)展更安全、高效、低成本、并可廣泛用于各類人群

2、的新型結(jié)核病疫苗已經(jīng)成為結(jié)核病預(yù)防工作中的當(dāng)務(wù)之急。同時，結(jié)核病也是人猴共患疾病之一，對人工飼養(yǎng)猴群的健康危害極大，人類結(jié)核病一旦感染猴群，呈爆發(fā)性疾病，可造成整個猴群的毀滅。缺乏敏感而特異的結(jié)核檢疫方法是造成實驗猴結(jié)核預(yù)防管理困難的原因之一，許多發(fā)達(dá)國家控制動物結(jié)核病的傳統(tǒng)策略“檢驗-屠宰”，在某些自然疫源再感染可能性較大的情況下是失敗的，同時帶來慘重經(jīng)濟(jì)后果(隔離、活動控制、宰殺)通常是在缺少臨床體征和癥狀的情況下僅根據(jù)感染的證據(jù)(

3、如目前的實驗動物檢疫主要采用的是皮內(nèi)進(jìn)行結(jié)核菌素試驗)決定的，而且由于人猴交叉感染，對飼養(yǎng)員及工作人員的健康也造成威脅；除此之外，現(xiàn)有的人用卡介苗(BCG)在預(yù)防猴針對牛型和人型結(jié)核分枝桿菌感染的能力上存在很大差異，目前也尚無用于預(yù)防猴類結(jié)核病的疫苗，所以對獸用新疫苗的需要顯得更為迫竊。因此，對于人工飼養(yǎng)猴群的繁殖和管理，對防止結(jié)核病在猴群中的傳播和確保猴質(zhì)量，也都亟待拓展獸類專用的疫苗和猴結(jié)核病檢測的方法。 借鑒在人結(jié)核疫苗研

4、制方面的技術(shù)和成果，致病菌中的單個或多個抗原表位能夠通過蛋白多肽或DNA疫苗的方式進(jìn)行免疫從而獲得免疫保護(hù)作用，在結(jié)核分枝桿菌中理想的抗原應(yīng)是在結(jié)核分枝桿菌感染初期被識別的抗原。已知人用亞單位疫苗研究中有明顯作用及部分作用的分泌型蛋白有：早期分泌性抗原靶6(ESAT6)、抗原85復(fù)合體(Ag85)、MPB64以及熱休克蛋白HSP65等，其中Ag85蛋白復(fù)合體是近年來研究的熱點。Ag85B是Ag85復(fù)合體中一種重要的分泌型蛋白，是人體抗結(jié)

5、核T細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要靶分子，這使其成為最具潛力的疫苗候選蛋白之一。在豚鼠模型中純化的Ag85B蛋白也能夠誘導(dǎo)持續(xù)的抗結(jié)核免疫保護(hù)，并且當(dāng)使用表達(dá)分泌Ag85B蛋白的重組卡介苗免疫動物時顯示出比傳統(tǒng)的卡介苗更強(qiáng)大的針對結(jié)核分枝桿菌氣溶膠攻擊的保護(hù)。表位疫苗是近年發(fā)展起來的一種嶄新的免疫接種技術(shù)，以保護(hù)性抗原上的特異性表位為基礎(chǔ)進(jìn)行疫苗分子設(shè)計，并以抗原表位為靶抗原，既能誘生特異性免疫應(yīng)答，又避免了天然蛋白中抑制性抗原表位引起的免疫抑制，

6、使免疫應(yīng)答具有更強(qiáng)的特異性和更好的免疫效果，且不存在生物危害性和遺傳變異致疫苗效力喪失等問題，因此，表位疫苗已成為研制感染性疾病和惡性腫瘤疫苗的方向。因此，借鑒表位疫苗在其它慢性感染性疾病中的研究成果，選擇在人類結(jié)核疫苗研究中具有免疫原性的抗原進(jìn)行合理的表位預(yù)測，以此表位為基礎(chǔ)設(shè)計的疫苗由于其小分子、穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)簡單等特性，有可能打破機(jī)體產(chǎn)生的免疫抑制，防止自身免疫反應(yīng)的發(fā)生，歸避病原體因自身快速基因突變所形成的免疫逃避作用，達(dá)到預(yù)防和治

7、療結(jié)核分枝桿菌感染的目的。 綜上，本研究擬在人用結(jié)核分枝桿菌疫苗開發(fā)研究的基礎(chǔ)上，利用猴結(jié)核分枝桿菌中存在的特有DNA序列嘗試開展一種適用于猴結(jié)核病鑒定的準(zhǔn)確而便捷的檢測方法；同時，嘗試對在人體中具有免疫保護(hù)性的相應(yīng)猴基因進(jìn)行克隆，從而進(jìn)行保護(hù)性抗原表位的尋找和免疫原性初步研究，為猴的結(jié)核病預(yù)防和猴結(jié)核表位疫苗的開發(fā)提供有益的幫助，也為人用結(jié)核表位疫苗的開發(fā)開辟新的視野。 我們首先根據(jù)本實驗室自身特點建立了一套結(jié)核分枝桿

8、菌猴鑒定的分子免疫學(xué)及細(xì)菌學(xué)基本技術(shù)，結(jié)合結(jié)核菌素實驗和猴咽拭子涂片抗酸染色技術(shù)，能夠較為準(zhǔn)確的鑒定出野生猴來源中的攜帶結(jié)核分枝桿菌的個體，從而得以從這些個體中獲得病理組織，提取其基因組。并通過標(biāo)準(zhǔn)株H37RV的Ag85B基因序列設(shè)計了引物用于擴(kuò)增野生猴來源Mycobacterium陽性猴的相應(yīng)基因。Blastn分析后發(fā)現(xiàn)，Ag85B基因在結(jié)核分枝桿菌多個種內(nèi)菌株，以及多個同屬不同種的菌株中高度保守，而在結(jié)核陽性猴中得到的Ag85B基因

9、也與此共同序列有99.05％的相似性?；诖诵蛄性O(shè)計的抗原多肽必然能夠起到針對多種結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的免疫保護(hù)作用。通過生物信息學(xué)方法的合理預(yù)測，篩選了抗原表位中能夠為最多MHC分子提呈并且處于蛋白外部的序列進(jìn)行人工合成，進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖實驗和抗體測試，結(jié)果顯示此抗原表位能夠有效的引起淋巴細(xì)胞增殖，有較好的免疫原性和抗原性。 此外，鑒于猴的目前活檢猴感染結(jié)核病的檢疫方法主要為結(jié)核菌素試驗。由于檢測方法的單一性及敏感性和

10、特異性低，加之結(jié)核病的變異性大，給靈長類結(jié)核病的診斷帶來困難。本實驗采用結(jié)核分枝桿菌早期分泌蛋白ESAT-6克隆作為陽性對照而建立的鑒定方法，能夠成功從活猴外周血中檢測出ESAT-6基因的存在，從而檢測出結(jié)核猴，通過ESAT-6 PCR的方法，我們在30只PPD陰性的野生來源猴小樣本調(diào)查中鑒定出1只陽性猴，較之結(jié)核菌素測試更為簡便和靈敏，通過進(jìn)一步的改進(jìn)和完善，將對猴群的養(yǎng)殖和管理帶來很大的益處。 通過上述工作，本研究證實Ag8