Hsp90α參與IBDV感染雞法氏囊細胞及其IBDV結合區(qū)的初步研究.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursal disease virus，IBDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，以嚴重免疫抑制和青年雞死亡率高為主要特征，對世界養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的損失。病毒感染的第一步是病毒與靶細胞受體的結合，因此研究IBDV受體對揭示病毒-細胞相互作用非常關鍵。熱應激蛋白90α(Heat shock protein90α，Hsp

2、90α)是細胞適應株IBDV感染雞成纖維細胞的受體之一或受體復合物成分，但在野毒株IBDV感染雞法氏囊細胞中的作用尚不清楚。類彈性蛋白多肽（Elastin-like polypeptide，ELP）具有溫度敏感可逆相變特性，在低于其相變溫度的溶液中呈溶解狀態(tài)，高于相變溫度的溶液中呈凝聚狀態(tài)，因此可用簡單的離心法進行其融合蛋白的分離純化。本課題組將ELP的相變特性與病毒受體結合特異性相結合，建立的病毒受體結合捕捉技術可用于腺病毒的濃縮、純

3、化和監(jiān)測。本研究利用相同原理，將雞Hsp90α及其cDNA片段與ELP進行融合表達，旨在探明Hsp90α的IBDV結合區(qū)，并為建立IBDV濃縮與純化方法奠定基礎。
　　為了初步確定Hsp90α的IBDV結合區(qū)，用RT-PCR從雞胚成纖維細胞擴增Hsp90α全長cDNA及其N端284個氨基酸編碼序列和C端444個氨基酸編碼序列，分別插入含ELP編碼序列的原核表達載體pET-ELP;分別將重組質粒pET-ELP-Hsp90α、pET-

4、ELP-N284和pET-ELP-C444轉化BLR(DE3)大腸桿菌，在20℃用IPTG誘導重組蛋白表達，在優(yōu)化條件下用ELP的溫度敏感逆向相變循環(huán)(ITC)純化融合蛋白;將純化的融合蛋白與IBDV孵育結合，用RT-PCR檢測病毒是否與重組Hsp90α及其片段結合。結果顯示:ELP與Hsp90α及其片段融合蛋白均為可溶性表達;ELP-Hsp90α和ELP-C444融合蛋白能與IBDV結合，而ELP-N284融合蛋白不能與IBDV結合，

5、表明Hsp90α的IBDV結合區(qū)位于C端444個氨基酸區(qū)域。
　　為了探明Hsp90α是否參與野毒株IBDV感染雞法氏囊細胞，從SPF雞胚分離培養(yǎng)法氏囊細胞，分別用RT-PCR和間接免疫熒光試驗檢測Hsp90α表達，以法氏囊細胞系DT40細胞和成纖維細胞系DF-1細胞為對照，結果顯示法氏囊細胞系及原代細胞均表達Hsp90α分子;分別用重組Hsp90α孵育IBDV和Hsp90α抗體孵育法氏囊細胞，間接免疫熒光試驗和病毒滴定檢測結果顯