腦組織PPARγ靶基因篩選.pdf

1、轉錄因子是一種重要的DNA結合蛋白(DNA-binding protein)，與染色質調節(jié)因子、表觀遺傳調控子共同作用在細胞基因重編程中發(fā)揮著重要作用，調節(jié)著細胞增殖、分化、衰老和生死的命運，和細胞再生以及腫瘤形成密切相關。由于轉錄因子在細胞生命活動中所處的重要位置，所以研究它有著重要的實際意義和價值。過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ)是

2、一種配體活化的核轉錄因子，為過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)家族成員之一，其另外兩個亞基分別是PPARα和PPARβ/δ。起初研究者認為PPARγ只存在于脂肪組織中，參與糖脂能量代謝調節(jié)，增強胰島素敏感性，維持機體穩(wěn)態(tài)。后有研究者發(fā)現PPARγ在大鼠脾臟以及人巨噬細胞和骨髓前體細胞中也有分布并參與抑制炎癥反應。近年來，神經生物學家發(fā)現在胚胎腦

3、組織及神經干細胞中PPARγ也大量存在并具有促進神經干細胞增殖與分化的功能，更有趣的是，盡管PPARγ在成年腦組織中表達量很低，但在中樞神經系統損傷后，其表達量顯著升高，這一發(fā)現發(fā)現提示我們PPARγ在神經形成、神經發(fā)育及神經損傷后修復中可能起著重要作用。實際上目前已有大量研究表明PPARγ在中風、脊髓損傷、神經退行性疾病中具有明顯的神經保護作用。
　　 關于PPARγ神經保護作用機制目前報道的有代謝紊亂糾正機制、抗炎、抗氧化、

4、抗凋亡機制以及促神經再生機制。PPARγ通過調節(jié)脂連素(adiponectin)、胰島素降解酶(insulin-degrading enzyme，IDE)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor，TNF-α）等因子活性，提高胰島素敏感性、增加葡萄糖利用率，糾正代謝紊亂;通過抑制核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide s

5、ynthase，iNOS)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)等促炎癥因子以及膠質細胞活性，減少炎癥因子產生;通過抑制NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)氧化酶活性以及促進過氧化氫酶、SOD(superoxide dismutase)等抗氧化酶活性，減少自由基生成;通過激活PI-3K/PDK-1/Akt通路促進Bad磷酸化，維持線粒體跨膜電位穩(wěn)定，

6、從而最終減輕因代謝紊亂、線粒體功能受損或炎癥反應、自由基生成引起的神經元和（或）神經膠質細胞損傷或凋亡。盡管已有研究表明PPARγ激動劑在脊髓損傷模型中能夠促進神經前體細胞增殖，但具體調控機制不明。研究者們除了研究PPARγ神經保護作用機制中的調節(jié)分子外，還對PPARγ的來源進行了分析。由于神經元內PPARγ較少，所以以往研究常認為是膠質細胞來源的PPARγ發(fā)揮的神經保護作用，然而近年來研究發(fā)現神經元PPARγ條件性敲除小鼠的腦組織對缺

7、血缺氧的耐受性降低，說明神經元來源的PPARγ同樣具有神經保護作用。
　　 最近研究發(fā)現神經元PPARγ除了具有神經保護作用外還參與神經調節(jié)，例如PPARγ通過作用于HPA軸和交感神經系統控制機體對心理應激反應性，下丘腦內PPARγ參與調節(jié)攝食和能量平衡等，然而其中的分子機制尚不清楚?；谀壳暗难芯楷F狀，我們一方面致力于探尋神經元PPARγ神經保護作用的新機制，另一方面試圖發(fā)現PPARγ潛在的新功能。神經保護作用新機制的研究主要

8、集中于找到與PPARγ有著直接關系，促進神經元生長、增殖、分化、突起生長、神經形成的基因，而PPARγ潛在的新功能則主要集中于找到與神經元信息傳遞關系密切，參與神經調節(jié)的基因，以期為神經系統疾病的治療找到新的治療靶點。為了找到PPARγ可能調節(jié)的基因，我們實驗首先利用芯片技術進行高通量篩選。具體做法，取兩只成年C57/B6J小鼠，一只腹腔注射12mg/kg體重羅格列酮，另一只腹腔注射相同體積DMSO作為對照，分別作用12h后，取全腦組織

9、;同時另外再取兩只腦內PPARγ條件性敲除[轉基因小鼠floxp PPARγ（PPARγfl/fl）與Nesin-Cre小鼠交配同窩出生的小鼠]小鼠，一只為對照小鼠，基因型為PPARγfl/flCre-/-，另一只為PPARγ敲除小鼠，基因型為PPARγfl/flCre+/-，不做任何處理，取全腦組織。每只小鼠腦組織一半送于芯片公司用于芯片實驗，另一半存留提取RNA（做定量PCR用，以備用來驗證芯片結果）。然后利用上海伯豪生物技術有限公

10、司SAS系統對芯片結果進行分析，我們首先選擇了如下基因，與細胞生長增殖密切相關的胰島素受體底物-4（insulin receptor substrate-4，IRS-4），參與神經元信息傳遞的重要神經遞質受體5-羥色按受體2C(serotoninreceptor2C，5-HTr2C)和γ-氨基丁酸受體α6(gamma-aminobutyric acid receptorsubunit alpha-6, GABRA6)。接下來我們在原代培

11、養(yǎng)的大鼠皮層神經元中對PPARγ與IRS-4、GABRA6、5-HTr2C的相關性進行驗證。取懷孕17-18天SD胎鼠皮層神經元，培養(yǎng)1周后，用10μM羅格列酮分別處理0h、1h、2h、4h、8h、24h。然后收集細胞提取RNA，利用RT-PCR技術對GABRA6 mRNA進行定性分析，利用RT-QPCR技術對IRS-4 mRNA、5-HTr2C mRNA進行定量分析。RT-PCR結果發(fā)現，羅格列酮處理1h和2h時GABRA6 mRNA

12、水平有上升趨勢但無統計學差異，至4h和8h時GABRA6 mRNA水平下降至基線水平，而處理24h時GABRA6 mRNA水平上升為未處理組的2.6倍(P=0.037)。RT-QPCR結果發(fā)現，羅格列酮處理4h和24h組IRS-4 mRNA分別增高為未處理組的1.47倍(P=0.007)和2倍(P=0.019)。激動劑各小時處理組5-HTr2C mRNA與未處理組相比，無統計學差異。體外實驗結果說明，活化PPARγ可能促進GABRA6和

13、IRS-4表達，但還不能排除PPARγ對5-HTr2C沒有影響。接下來我們又在體內實驗中對PPARγ與IRS-4、5-HTr2C之間的關聯進行驗證，與此同時本實驗還引入了另外三個基因一并進行研究，他們分別是突觸結合蛋白-2（synaptotagmin2，Syt2）為主要的Ca2+傳感器，調節(jié)快速神經遞質釋放;叉頭框蛋白C2(forkhead box C2，Foxc2)是重要的轉錄因子，主要調節(jié)與代謝、血管生成/再生及重塑相關基因的表達，

14、其突變與肥胖、先天畸形、腫瘤發(fā)生關系密切;基因周期監(jiān)測點激酶1(checkpoint kinase1，Chek1)為細胞周期檢測系統中的重要因子，維持基因組穩(wěn)定，具有抗凋亡作用，其異常表達與腫瘤形成密切相關。首先取成年雄性C57BL/6J小鼠6-10只，體重22-24g，隨機分成兩組，對照組(DMSO)和激動劑組(RSG)，每組3-5只，激動劑組腹腔注射12mg/kg體重的羅格列酮，作用12h，對照組給予等體積10％ DMSO。然后分離

15、皮層、海馬，分別提取RNA和蛋白質，用于RT-QPCR實驗和免疫印跡實驗。RT-QPCR結果發(fā)現，與對照組相比，皮層組織激動劑組IRS-4 mRNA、5-HTr2C mRNA、Check1 mRNA表達分別上升40％、63％、28％(P＜0.001，P=0.006，P＜0.001)，Foxc2 mRNA表達下降41％(P＜0.001)，Syt2 mRNA表達量有下降趨勢但無統計學差異;海馬組織激動劑組Syt2 mRNA表達上升51.5％

16、(P=0.002)，Foxc2mRNA表達下降51％(P=0.013)，其它基因mRNA表達無差異。免疫印跡實驗結果發(fā)現，皮層組織激動劑組5-HTr2C蛋白水平較對照組上升25.8％，海馬組織激動劑組5-HTr2C蛋白水平與對照組相比沒有統計學差異。因IRS-4抗體源性的限制，目前市場上用于實驗的IRS-4抗體多為人源性或大鼠源的，小鼠源性的幾乎沒有，所以本實驗中沒有得到IRS-4在小鼠皮層、海馬組織中免疫印跡實驗結果的數據。Foxc2

17、、Syt2、Check1尚在繼續(xù)驗證中，對其蛋白水平還未予以檢測。體內實驗說明PPARγ激動劑促進皮層內IRS-4、5-HTr2C、Chek1和海馬內Syt2表達，而抑制皮層和海馬內Foxc2表達。
　　 為了說明腦內PPARγ對備選基因的調控作用，我們利用腦內PPARγ條件性敲除小鼠來研究腦內PPARγ缺乏對IRS-4、5-HTr2C、Foxc2、Syt2、Check1表達的影響。首先我們從基因型、條件性敲除小鼠特異性包含Cr

18、e介導重組體PPARγ（Cre-mediate recombinant PPARγ）以及PPARγ mRNA在不同組織中的變化情況這三個方面對轉基因小鼠進行基因鑒定分析，然后根據鑒定結果取成年雄性轉基因小鼠6-10只，體重22-24g，分成對照組（PPARγfl/fl，fl/fl）和基因敲除組（brain PPARγ knockout，BKO）兩組，每組各3-5只，fl/fl組基因型為PPARγfl/flCre-/-，BKO組基因型為P

19、PARγfl/fllCre+/-。用RT-QPCR技術檢測PPARγ對IRS-4、5-HTr2C、Foxc2、Syt2、Checkl在基因水平上的影響，同時用免疫印跡技術檢測PPARγ對5-HTr2C在蛋白水平上的影響。小鼠基因型檢測(PCR)結果可見，fl/fl小鼠在230bp處有特異性條帶，100bp處無條帶，說明PPARγfl/fl陽性、Cre陰性，基因型為PPARγfl/flCre-/-;BKO小鼠在230bp和100bp處均有

20、條帶，說明PPARγfl/fl、Cre均陽性，基因型為PPARγfl/flCre+/-。重組體PPARγ檢測(RT-PCR)結果可見，除了BKO小鼠腦組織（皮層、海馬）條帶在300和400bp處外，其余均在700bp處，說明重組體PPARγ特異性表達在腦組織中。PPARγ mRNA實時定量PCR檢測結果可見，BKO小鼠腦組織內（包括皮層和海馬）PPARγ mRNA相對表達量明顯降低，幾乎無法檢測到，和PPARγfl/fl(fl/fl)組

21、相比差異顯著(P＜0.001);肝組織中PPARγ mRNA表達量和PPARγfl/fl(fl/fl)組相比沒有差異，肌肉和脾臟組織中PPARγ mRNA表達量和PPARγfl/fl(fl/fl)組相比分別減少0.3倍和增加0.6倍。和腦組織PPARγ變化量相比，腦外組織PPARγ變化量微乎其微，說明腦內PPARγ條件性敲除是成功的。各基因RT-QPCR結果發(fā)現，與對照組相比，PPARγ條件性敲除小鼠皮層組織中IRS-4 mRNA、5-

22、HTr2C mRNA、Chek1 mRNA分別下降14％、45.5％、24％（P=0.04，P＜0.001，P=0.037），Foxc2 mRNA、Syt2 mRNA表達無差異。PPARγ條件性敲除小鼠海馬組織中IRS-4 mRNA、5-HTr2C mRNA表達水平較對照組無統計學差異，Foxc2 mRNA、Chek1 mRNA表達分別上升為對照組的3.68倍和1.22倍(P=0.044，P=0.001)，Syt2 mRNA表達較對照組

23、下降33％(P=0.023)。免疫印跡結果未檢測到PPARγ條件性敲除小鼠皮層和海馬組織中5-HTr2C蛋白水平發(fā)生變化。RT-QPCR結果說明PPARγ激動劑促進皮層內IRS-4 mRNA、5-HTr2C mRNA、Chek1 mRNA和海馬內Syt2表達以及抑制海馬內Foxc2 mRNA表達是腦內PPARγ依賴的。為了進一步說明IRS-4、5-HTr2C、Foxc2、Syt2、Check1受腦內PPARγ調節(jié)，我們接下來取成年雄性B

24、KO小鼠6-10只，體重22-24g，隨機分成兩組，對照組(DMSO)和激動劑組(RSG)，每組3-5只，激動劑組腹腔注射12mg/kg體重的羅格列酮，對照組給予等體積10％ DMSO，作用12h后，分離皮層、海馬，提取RNA，用于RT-QPCR實驗。RT-QPCR結果發(fā)現，與對照組相比，皮層組織激動劑組IRS-4 mRNA水平上升40％(P=0.016)，Foxc2 mRNA、Syt2 mRNA分別下降32.5％、61％(P=0.01

25、3， P＜0.001)，5-HTr2C mRNA、Check1 mRNA無統計學差異。海馬組織激動劑組5-HTr2C mRNA、Foxc2 mRNA較對照組分別下降28％和80％(P=0.014,P＜0.001),IRS-4 mRNA、Syt2 mRNA、Check1 mRNA無統計學差異。說明PPARγ促進皮層組織5-HTr2C、Check1和海馬組織Syt2表達是PPARγ完全依賴的，而對IRS-4、Foxc2的表達則有可能是和其它