鈣調蛋白激酶Ⅱ活化藥物高通量篩選模型的建立;骨髓基質干細胞治療腦中風機理探討.pdf

1、在神經元和其他神經細胞中，鈣調蛋白激酶Ⅱ具有非常重要的生理作用，其活化是一系列生理學改變的基礎，因此實時有效檢測鈣調蛋白激酶Ⅱ活性具有相當重要的意義。有實驗表明在GFP融合蛋白的某個氨基酸殘基磷酸化會導致GFP熒光改變。作為鈣調蛋白激酶Ⅱ特異性底物，突觸素Ⅰa能夠被鈣調蛋白激酶Ⅱ有效磷酸化。為了實時監(jiān)測鈣調蛋白激酶Ⅱ的活化情況，我們通過轉染GFP-突觸素Ⅰa融合蛋白基因至PC12細胞，建立一株能夠穩(wěn)定表達GFP-突觸素Ⅰa融合蛋白的細胞

2、系。1.56mmol/L至50mmol/L濃度的CaCl2在不同程度上增加此細胞株表達的GFP-突觸素Ⅰa融合蛋白熒光強度，這種熒光增強現象可能歸因于熒光共振能量轉移作用。使用激光共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測分析也發(fā)現25mmol/LCaCl2能夠明顯增加單個細胞中熒光強度。另一方面10μmol/LKN-93(鈣調蛋白激酶Ⅱ特異性抑制劑)預處理細胞，可以明顯抑制甚至降低2mmol/LL-Glu處理細胞引起的熒光強度增加，但是PKA特異性激活劑2

3、mmol/LDb-cAMP不能使細胞熒光強度增加，說明熒光強度增加主要是由于突觸素Ⅰa位點2和3被鈣調蛋白激酶Ⅱ磷酸化所致而不是由于位點1被鈣調蛋白激酶Ⅰ磷酸化引起。Westernblot結果也證實，在鈣調蛋白激酶Ⅱ和突觸素Ⅰa蛋白表達總量不變情況下，鈣調蛋白激酶Ⅱ以及突觸素Ⅰa磷酸化水平在細胞經25mmol/LCaCl2處理后明顯升高，同樣，KN-93預處理能夠抑制甚至降低鈣調蛋白激酶Ⅱ以及突觸素Ⅰa磷酸化水平。因此可通過表達GFP-

4、突觸素Ⅰa融合蛋白的細胞監(jiān)測鈣調蛋白激酶Ⅱ的活化情況，建立起的該細胞系也可以作為潛在的鈣調蛋白激酶Ⅱ活化劑的高通量篩選模型。 一、BMSCs參與腦缺血后大腦功能的重建 外部各種因素影響干細胞選擇性表達各種組織特異性基因，可以對細胞表型產生重塑，達到定向分化的效果。synapsin作為神經元特異表達的一種蛋白質，具有多方面的功能，基因敲除以及反義核苷酸拮抗試驗表明synapsin在神經元突起的產生以及延長、軸突分化生長以及

5、維持、成熟等方面起著重要的作用。本實驗通過研究缺血腦組織抽提液對培養(yǎng)BMSCs三個亞型synapsin基因表達的影響，發(fā)現三個亞型synapsin基因的表達經缺血腦組織抽提液培養(yǎng)后均有一定程度變化，特別是synapsinⅡa基因的表達在經缺血48小時腦抽提液培養(yǎng)處理后有顯著升高。進一步使用含三個亞型不同synapsin基因pL(SYNⅠa)SN、pL(SYNⅡa)SN、pLNC(SYNⅢa)逆轉錄病毒載體介導感染基因進入大鼠BMSCs，

6、經預誘導24小時以及誘導8小時后，大鼠BMSCs能夠分化形成神經元形態(tài)的細胞，免疫熒光檢測結果表明部分分化細胞表達GFAP或者NF200；與對照組相比，三種亞型synapsin的表達均能顯著提高NF200表達細胞數量，這種作用以SynapsinⅡa為最明顯，SynapsinⅠa最弱。而表達GFAP的細胞數量沒有明顯改變；實驗結果表明缺血后大腦環(huán)境的改變能夠促進BMSCssynapsin表達，這種基因表達增高能夠有效地對骨髓基質干細胞所分

7、化的細胞表型進行重塑，使其定向分化為神經元樣細胞，并且參與缺血后大腦功能的重建，在BMSCs促進缺血后大腦功能恢復方面起到一定的作用。 二、BMSCs分泌可溶性生長因子抑制大腦缺血陰影區(qū)細胞凋亡、維持細胞存活 TUNEL染色顯示MCAo后在大鼠腦組織缺血陰影區(qū)發(fā)生大量的細胞凋亡，BMSCs治療能夠顯著地降低凋亡細胞的數量。為了探討B(tài)MSCs抑制凋亡的機理，缺糖缺氧培養(yǎng)的星形膠質細胞用于模擬體內的缺血環(huán)境。實驗結果顯示，缺

8、糖缺氧培養(yǎng)能夠誘導星形膠質細胞凋亡發(fā)生，BMSCs共培養(yǎng)顯著降低凋亡細胞數量。Westernblot分析結果表明，缺糖缺氧處理后星形膠質細胞中NFκB活化顯著上升，BMSCs共培養(yǎng)能夠通過抑制IκB的磷酸化而降低NFκB的活化。同時，缺糖缺氧培養(yǎng)星形膠質細胞可以導致凋亡誘導基因Bax表達升高，而BMSCs共培養(yǎng)則降低這種表達升高現象。BMSCs共培養(yǎng)還升高星形膠質細胞中c-Myc和Bcl-xl凋亡抑制基因的表達。由于已有實驗證實EGF具

9、有抗凋亡，促增值以及維持細胞存活的作用，因此我們用缺血后腦組織抽提液培養(yǎng)BMSCs，實時定量RT-PCR結果顯示，缺血48小時的腦組織抽提液能夠顯著地增加BMSCs中EGFmRNA水平，EGF表達水平升高可能是BMSCs抑制凋亡發(fā)生的主要因素。本實驗結果表明BMSCs通過抑制缺血后大腦NFκB活化水平，改變一些凋亡誘導基因或抑制基因的表達，降低大腦缺血后的細胞凋亡損傷，從而達到改善神經功能，促進損傷修復的作用。 三、BMSCs通

10、過增高缺血區(qū)星形膠質細胞BMPs表達而增加內源性干細胞或前體細胞分化為星形膠質細胞并參與缺血后大腦的重建 骨形成蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)影響細胞的增殖和分化過程。缺血后大腦中的星形膠質細胞對BMSCs反應強烈。我們采用一種部分模擬大腦缺血環(huán)境的體外模型，即在缺氧和缺糖的條件下培養(yǎng)星形膠質細胞，研究BMSCs處理后星形膠質細胞中BMPs表達的改變，后者可能對缺血后大鼠神經功能恢復方面具有

11、一定的作用。定量實時RT-PCR分析表明缺血后星形膠質細胞中BMP2/4表達降低，BMSCs處理后，缺血星形膠質細胞中BMP2/4表達水平明顯提高；Westernblotting結果也證實了在BMSCs共培養(yǎng)的缺血星形膠質細胞培養(yǎng)液中BMP2/4蛋白水平升高現象。作為一類神經干細胞或前體細胞的來源，體外培養(yǎng)大腦室下區(qū)(subventricularzone，SVZ)細胞在整個大鼠一生尤其是缺血后能夠參與大腦的神經再生。在體外培養(yǎng)SVZ神經

12、球，用以探討B(tài)MSCs處理缺血后星形膠質細胞產生的BMP2/4水平變化是否影響大腦神經再生過程。采用缺血星形膠質細胞與BMSCs共培養(yǎng)的培養(yǎng)液能夠顯著增加星形膠質細胞標志物GFAP的表達，但是這種增加并不代償性降低β-Ⅲ-tubulin陽性SVZ成神經細胞的數量，另外升高的BMP2/4水平引發(fā)了培養(yǎng)SVZ神經球細胞中BMP下游效應物Smad1/5/8磷酸化水平增高以及Hes1(一種Notch信號通路誘導蛋白)表達升高，BMP特異性抑制劑