嗜酸性喜溫硫桿菌中連四硫酸鹽介導的硫代硫酸鹽代謝途徑(S4I)的調控機制研究.pdf

1、嗜酸性喜溫硫桿菌(Acidithiobacillus caldus，簡稱A.caldus)是一種化能自養(yǎng)細菌，能夠氧化元素硫和各種還原性的無機硫化合物，并從中獲得能量和還原力，以此來完成自身的生長代謝。A.caldus是生物冶金工業(yè)中常見的應用菌株，其生長的最適pH和最適溫度分別為1.5-2.5和40-50℃。A.caldus體內存在一套復雜而又高效的無機硫化合物的代謝系統(tǒng)。其中，硫代硫酸鹽又是在整個硫代謝系統(tǒng)中重要的中間代謝物，它能夠

2、通過連四硫酸鹽介導的硫代硫酸鹽代謝途徑(S4I pathway)進行代謝。因此，揭示S4I途徑的作用和調控機制，對于深入了解A.caldus整個硫代謝系統(tǒng)，以及相關的調控機制，具有重要的的理論指導意義。
　　S4I途徑中包含有兩種酶:硫代硫酸鹽泛醌氧化還原酶(Tqo或DoxDA)和連四硫酸鹽水解酶(TetH)。這兩種酶的編碼基因位于同一個基因簇上(tetH基因簇)。通過生物信息學發(fā)現(xiàn)，在tetH基因簇上，tetH基因前還存在rsr

3、R和rsrS兩個基因，編碼一套雙組分的調控系統(tǒng)。因此，結合A.caldus在單質硫培養(yǎng)過程硫代謝相關基因及一些調控基因的明顯的變化規(guī)律，推斷雙組分調控系統(tǒng)RsrS-RsrR極有可能調控S4I途徑。
　　本論文即針對上述要解決的問題，從以下幾個方面開展了研究工作:
　　一、A.caldus中培養(yǎng)過程的全基因組表達譜分析
　　A.caldus在單質硫為能源的培養(yǎng)過程中，隨著單質硫的活化氧化，產生各種可代謝的硫化合物，進而開

4、啟相關代謝途徑。為了闡釋在單質硫培養(yǎng)過程中，各種硫代謝途徑及其相關調控基因在整個過程中的轉錄變化情況，利用全基因組芯片對單質硫培養(yǎng)過程（2天、4天、6天8天和10天）進行了系統(tǒng)的轉錄組分析，結果表明A.caldus的硫代謝相關基因及一些調控基因具有明顯的變化規(guī)律，為系統(tǒng)研究硫代謝的調控機制提供了思路和線索，為從整體上認識理解硫代謝的調控網(wǎng)絡奠定了基礎。在分析部分調控基因的過程轉錄情況時，發(fā)現(xiàn)分別有兩套雙組分調控系統(tǒng)可能與硫代謝相關，其中

5、，雙組分調控系統(tǒng)RsrS-RsrR可能調控A.caldus的S4I途徑。
　　二、使用無痕敲除技術進行雙組分調控系統(tǒng)RsrS-RsrR編碼基因的無痕敲除
　　本文基于同源重組的原理，使用無痕敲除技術，分別通過構建自殺質粒pSDUDI∷rsrR(UHA+ DHA)和pSDUDI∷rsrS(UHA+DHA)，經(jīng)過接合轉移操作，使用同源臂內測引物、外側基因和基因內部引物篩選驗證，成功獲得了rsrR和rsrS基因的敲除株。敲除株的獲

6、得，對于研究雙組分調控系統(tǒng)RsrS-RsrR的功能是最基本而又最重要的步驟。
　　三、△rsrR、ArsrS生長曲線分析
　　在獲得△rsrR、△rsrS敲除株后，分別檢測了其在以硫粉或連四硫酸鹽作為底物能源時的生長狀況，分析了與野生型的生長差異。結果在硫粉培養(yǎng)時，兩個敲除株相對于野生型沒有表現(xiàn)出明顯的差異。然而，在連四硫酸鹽培養(yǎng)時，分別表現(xiàn)出了2天和4天的生長延遲。另外，針對這兩個敲除株構建的回補菌株的生長曲線，表明在被敲

7、除的基因得到回補后，生長曲線又恢復到與野生型一致。這一結果對于分析和推斷rsrR、rsrS基因在硫代謝調控，尤其是S4I途徑中的作用具有重要意義。
　　四、連四硫酸鹽刺激時A.caldus中tetH基因簇基因表達研究
　　S4I途徑是目前硫氧化細菌中唯一明確的能夠代謝連四硫酸鹽的途徑，而RsrS-RsrR雙組分調控系統(tǒng)又極有可能調控該途徑。因此，在使用硫粉培養(yǎng)A.caldus時，通過加入連四硫酸鹽刺激，使用RT-qPCR檢測

8、tetH基因簇中基因的轉錄變化情況。結果野生型的tetH基因簇中的基因在連四硫酸鹽刺激后均發(fā)生了明顯的表達上調;而ArsrR、△rsrS敲除株，由于雙組分調控系統(tǒng)的缺失，使得調控途徑中斷，導致tetH基因簇中的基因在連四硫酸鹽刺激后并沒有出現(xiàn)明顯的表達變化。從而可以推斷和初步驗證RsrS-RsrR雙組分調控系統(tǒng)對于S4I途徑的正向調控功能。
　　五、A.caldus中tetH基因簇的分析研究
　　在喜溫硫桿菌中，S4I途徑是

9、硫代謝系統(tǒng)的重要組成部分，該途徑包含的連四硫酸鹽水解酶(TetH)和硫代硫酸鹽泛醌氧化還原酶(DoxDA)，在多種硫氧化微生物中都存在。對喜溫硫桿菌屬和其他硫氧化細菌，甚至含有相似代謝途徑的古菌進行分析，發(fā)現(xiàn)喜溫硫桿菌在tetH和doxDA基因前獨特的進化出了一套RsrS-RsrR雙組分調控系統(tǒng)的編碼基因。這對于更有序高效的調控復雜的硫氧化系統(tǒng)是有利且必須的。
　　另一方面，通過生物信息學分析喜溫硫桿菌中tetH基因簇的啟動子情況

10、。并通過構建探測質粒進行外源測GusA酶活，內源RT-qPCR技術檢測gusA基因轉錄等方式，驗證了可能的啟動子。而且通過cDNA末端快速擴增技術確定了doxDA的啟動子區(qū)域及轉錄起始位點。這些工作對于從整體上了解整個tetH基因簇的基因轉錄以及對于揭示調控的機制具有一定的意義。
　　六、RsrS-RsrR雙組分調控系統(tǒng)對于S4I途徑的調控研究
　　通過優(yōu)化的凝膠遷移實驗(EMSA)驗證了RsrR蛋白與tetH前的啟動子序列

11、之間的相互作用。另一方面，構建一系列報告基因探測質粒，pJRD-P360IRS-gusA，pJRD-P148IRS-gusA和pJRD-P90-gusA，在A.caldus體內驗證了RsrR蛋白與tetH前的啟動子序列之間的相互作用。
　　結合生物信息學分析，初步確定tetH前的啟動子上一段19 bp的反向重復序列(IRS，AACACCTGTTACACCTGTT)極有可能是RsrR蛋白的調控序列。然而，通過DNase I足跡實驗，

12、則確定了一段22 bp的調控序列。這兩種實驗方法各有優(yōu)勢和不足，下一步工作會通過調控序列關鍵位點突變等方法來確定RsrR蛋白準確的調控序列。
　　七、A.caldus中RsrS和RsrR結構及cross-talk功能的初步研究
　　本文通過進化樹鄰接法分析了RsrS和RsrR兩個蛋白可能的來源或者歸類，并對其進行了蛋白結構的數(shù)學模擬和疊合。結果發(fā)現(xiàn)，RsrS-RsrR雙組分調控系統(tǒng)與涉及滲透壓的雙組分調控系統(tǒng)EnvZ-Omp

13、R具有高度相似性。這些分析結果是兩者之間能夠發(fā)生共調控或這cross-talk現(xiàn)象的重要的理論基礎。結合之前驗證敲除株在連四硫酸鹽培養(yǎng)下生長延遲的生理特性，有理由相信極有可能是EnvZ-OmpR在RsrS-RsrR缺失時，保證了兩個敲除株在連四硫酸鹽里的生長。同時，通過分析得出的幾個有關的雙組分蛋白(RR)，與tetH基因的啟動子序列的EMSA實驗，結果A5904_2590(OmpR)確實能夠結合tetH前的啟動子序列。另一方面，分析了

14、RsrR蛋白結合DNA片段的HTH結構域中一些關鍵的氨基酸位點。這些分析和研究結果這對于解釋連四硫酸鹽培養(yǎng)下生長延遲的現(xiàn)象和完善S4l途徑的調控機制具有重要的意義。
　　八、△rsrR、△rsrS中硫代謝相關基因及部分調控基因的研究
　　A.caldus中S4I途徑涉及到連四硫酸鹽和硫代硫酸鹽之間的互相轉化，而硫代硫酸鹽又是整個硫代謝系統(tǒng)的重要的中間代謝物，說明S4I途徑與其他的硫氧化途徑有密切的聯(lián)系。目前的研究表明了雙組分

15、調控系統(tǒng)RsrS-RsrR對S4I途徑的調控作用。因此，通過RT-qPCR檢測△rsrR、△rsrS敲除株中硫氧化基因的轉錄變化情況，對于分析S4I途徑與其他的硫氧化途徑之間的影響和聯(lián)系具有重要意義。
　　另一方面，△rsrR、△rsrS敲除株在連四硫酸鹽培養(yǎng)基中出現(xiàn)生長延遲。目前的研究結果表明很有可能是與其他雙組分調控系統(tǒng)間的共調控或者cross-talk相關。因此，也對敲除株中其他雙組分調控系統(tǒng)及單組分調控蛋白的編碼基因的轉錄

16、變化情況進行了檢測。
　　RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)， rsrS和rsrR的敲除對于硫代謝相關基因及部分調控基因均有影響。但是，不管是影響的基因數(shù)目還是影響的基因表達變化的程度上，rsrR的敲除產生的影響要明顯大于rsrS的敲除帶來的影響。
　　九、A.caldus中RsrS-RsrR調控S4I途徑的基本模型的提出
　　通過整個工作的實驗結果驗證，結合生物信息學分析，提出了A.caldus中RsrS-RsrR調控S4I途徑

17、的基本模型。在A.caldus硫代謝系統(tǒng)中的S4I途徑中，雙組分調控系統(tǒng)中的組氨酸激酶RsrS的感受結構域從連四硫酸鹽感受刺激，使其DHp結構域中的活性組氨酸位點從ATP獲得磷酸基團后被活化;經(jīng)過催化結構域CA的催化作用，將磷酸基團轉移給雙組分調控系統(tǒng)中的調控蛋白RsrR的信號接收結構域REC保守的活性天冬氨酸Asp(D)位點上并被活化;RsrR形成同源二聚體，結合到tetH基因前啟動子序列中的調控序列上;激活RNA聚合酶，調控tetH

18、基因簇的轉錄。tetH和doxDA基因轉錄后表達產生TetH和DoxDA蛋白，進入周質空間后，實現(xiàn)了連四硫酸鹽和硫代硫酸鹽之間的互相轉化，從而參與到整個硫代謝氧化系統(tǒng)中。
　　本文通過A.caldusMTH-04全基因組的芯片表達譜分析，分析了喜溫硫桿菌在生長過程中硫代謝及相關調控基因的轉錄變化情況。通過基因無痕敲除技術成功構建了雙組分調控系統(tǒng)RsrS-RsrR的敲除菌株;通過體內和體外的實驗驗證了雙組分調控系統(tǒng)RsrS-RsrR