HELA荷瘤鼠MDSC與HMGB1的檢測及恩度體外抗瘤作用研究.pdf

1、目的:
　　本研究通過檢測小鼠宮頸癌移植瘤模型中HMGB1和髓源性抑制細胞(MDSC)的表達水平，分析兩者在腫瘤微環(huán)境中的相關性及作用;同時，探討缺氧情況下，重組人血管內皮抑制素(恩度)體外誘導Hela宮頸癌細胞凋亡的機制，為宮頸癌免疫干預治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.人宮頸癌Hela細胞系建立裸鼠皮下種植瘤模型，成瘤后取荷瘤小鼠的脾臟、腫瘤組織及外周血制成單細胞懸液，通過流式細胞術(FCM)檢測脾臟、外周血

2、中MDSC細胞的百分比例。
　　2.分別采用Western blotting、RT-qPCR方法檢測癌和癌旁組織中HMGBl蛋白和mRNA的表達水平。
　　3.通過Percoll密度梯度離心法和免疫磁珠分選法，分離、純化荷瘤鼠脾臟來源的MDSC細胞，RT-qPCR檢測純化后的MDSCs自身Arg-1和iNOS的mRNA表達水平。
　　4.體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細胞，在低氧的環(huán)境下分別給予以下處理24小時:PBS、恩度

3、、恩度聯(lián)合3-甲基腺嘌呤(3-MA)，通過Hoechst33258染色及Annexin V-FITC/PI雙染結合FCM檢測Hela細胞的凋亡水平，Western blotting檢測微管相關蛋白輕鏈3(LC-3)、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax的表達。
　　結果:
　　1.與正常對照組相比，荷瘤鼠外周血和脾臟中CD11b+Gr-1+MDSC的比例明顯增高(p＜0.05)。與癌旁組織對照組相比，荷瘤鼠腫瘤組織中HMG

4、B1呈明顯高表達，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。荷瘤鼠脾臟中CD11 b+Gr-1+MDSC％增高與腫瘤組織中HMGB1的高表達呈正下相關。
　　2.免疫磁珠分選法純化MDSCs的純度明顯優(yōu)于Percoll密度梯度離心法，純度可達89％左右。與正常鼠相比，從荷瘤鼠組分離出的MDSCs自身明顯高表達Arg-1和iNOS，具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。
　　3.Hoechst33258染色提示恩度在低氧環(huán)境下可以誘導Hela

5、細胞出現(xiàn)核碎裂，說明誘導了細胞的凋亡;同樣的，Annexin V-FITC/PI染色結合FCM檢測發(fā)現(xiàn)恩度處理組誘導細胞凋亡率明顯高于另兩組;Western blotting跟其結果相一致，與另兩組相比，恩度處理HeLa細胞后，LC-3及Bax蛋白表達水平明顯升高且Bcl-2蛋白表達降低。
　　結論:
　　宮頸癌腫瘤微環(huán)境中，HMGB1的高表達與MDSCs的累積數(shù)量呈正相關，且與正常鼠相比，荷瘤鼠中MDSCs過表達免疫抑制介