抑制Evi1基因表達促進BMSCs成骨分化治療骨質(zhì)疏松癥的研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞、導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。隨人類壽命的延長和社會老年化的到來，骨質(zhì)疏松癥已成為人類重要的健康問題。
　　目前對骨質(zhì)疏松的治療措施主要分為基礎(chǔ)措施和藥物治療兩個方面。基礎(chǔ)治療措施中主要是補充鈣劑和維生素D。藥物治療主要包括抗骨吸收藥物、促骨形成藥物和其他藥物。但由于對骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制并不完全清楚，所以當(dāng)前對于骨質(zhì)疏松的治療并不理想。因此

2、，進一步研究骨質(zhì)疏松形成機制以及尋求更好的治療方法，降低骨折發(fā)病率和提高生活質(zhì)量是當(dāng)前骨質(zhì)疏松治療研究的重點。
　　骨質(zhì)疏松發(fā)病機制有很多，目前也取得了很多進展。近年來有越來越多的證據(jù)證明骨質(zhì)疏松與骨髓間充質(zhì)干細胞的相對缺乏相關(guān)；而且大量的研究發(fā)現(xiàn)患有骨質(zhì)疏松的絕經(jīng)期女性與正常女性相比不但常常伴有骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化能力的降低，同時伴有骨髓組織中脂肪成分的增加。那么也就是說骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化能力的增加也可能是骨質(zhì)疏

3、松的發(fā)病機制。是不是抑制了骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂分化就能在一定程度上緩解骨質(zhì)疏松的進程。
　　要抑制骨髓間充質(zhì)干細胞向脂肪分化，我們首先要明確骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化的關(guān)健調(diào)控因素。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)異位病毒整合位點1（ectopic viral integration site，Evi1）是前脂肪細胞3T3-L1分化為成熟脂肪細胞的決定因素；干擾該基因的表達則會阻斷3T3-L1細胞向成熟脂肪細胞分化的進程。骨髓間充質(zhì)干細胞可以分成為脂

4、肪細胞，也可視為一種前脂肪細胞，異位病毒整合位點也應(yīng)該會決定其向脂肪細胞分化的過程。基于以上，提出三點假設(shè)：在骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂肪分化過程中存在Evi1基因的表達；Evi1基因決定骨髓間充質(zhì)干細胞的成脂肪分化；抑制Evi1基因的表達可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨細胞分化。
　　本實驗從細胞研究及動物實驗兩個方面對以上問題展開了研究工作，研究內(nèi)容主要包括以下四個部分：
　　1、提取骨髓間充質(zhì)干細胞并進行培養(yǎng)和鑒定。

5、　　2、在干細胞成脂分化過程中研究Evi1基因的表達以及如何表達。
　　3、構(gòu)建腺病毒載體，采用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞并測定其干擾效率和干擾作用。
　　4、制作大鼠骨質(zhì)疏松模型，通過尾靜脈注射腺病毒轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞，觀察對骨質(zhì)疏松的治療效果。
　　第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　目的：
　　學(xué)習(xí)并掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)技術(shù)，并進行細胞形態(tài)學(xué)、細胞增殖、細胞

6、表面標記物、成骨成脂誘導(dǎo)分化的鑒定。為進一步的實驗提供研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.實驗動物
　　雌性SPF級Sprague Dawley（SD）大鼠，體重100-120g,由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供。
　　2．大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的原代分離培養(yǎng)
　　5％水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠，無菌條件下快速取大鼠的股骨及脛骨

7、，去除肌肉等軟組織，PBS清洗干凈。剪掉長骨的骨骺端，露出骨髓腔，用含有100U/ml青、鏈霉素和10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，直至骨質(zhì)發(fā)白；將沖出的骨髓內(nèi)容物分置于培養(yǎng)瓶中，每只動物骨髓可接種兩個T25培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。
　　3.BMSCs的培養(yǎng)、純化及傳代
　　在原代培養(yǎng)過程中，24小時后更換全部培養(yǎng)基，以后每周更換兩次完全培養(yǎng)液，待細胞鋪滿培養(yǎng)皿約90%時，使用胰酶-EDTA溶

8、液消化，1:4/5的比例進行傳代培養(yǎng)。
　　4.BMSCs的形態(tài)學(xué)檢查
　　培養(yǎng)后使用倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化以及生長情況，并進行拍照。
　　5.流式細胞術(shù)測定的細胞表面標記物表達
　　取第3代生長狀態(tài)良好BMSCs，胰酶-EDTA溶液消化，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，倒置顯微鏡下計數(shù)細胞，依次在各管中加入單克隆抗體 CD34, CD44, CD45和CD904℃條件下孵育30分鐘，用PBS液洗滌細胞3次，以

9、除去未結(jié)合抗體，與FITC標記和PE標記的二抗避光作用30分鐘，再用PBS液重懸細胞并置于冰上，上流式細胞儀進行檢測分析。
　　6. BMSCs的成骨成脂誘導(dǎo)分化能力
　　取第3代生長良好的BMSCs，接種于6孔細胞培養(yǎng)板，待細胞貼壁生長至細胞密度達80-90%時，在各誘導(dǎo)孔的完全培養(yǎng)液中分別加入成骨細胞誘導(dǎo)劑和成脂細胞誘導(dǎo)劑，各誘導(dǎo)孔每3-4天換液1次，同時設(shè)置L-DMEM完全培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)孔作為空白對照。成骨細胞誘導(dǎo)劑

10、誘導(dǎo)16天后，室溫下4%多聚甲醛固定10分鐘，對誘導(dǎo)分化的成骨細胞進行茜素紅染色；成骨誘導(dǎo)時細胞密度要求達到100%，成脂細胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)21天后，4%多聚甲醛固定，對誘導(dǎo)分化的脂肪細胞進行油紅O染色。倒置顯微鏡下觀察并拍照。
　　結(jié)果：
　　1.BMSCs的形態(tài)學(xué)觀測
　　SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞形態(tài)主要呈梭形細胞，細胞集落呈放射狀排列，細胞長勢良好，可穩(wěn)定傳代20代以上。
　　2.BMSCs表面標記物的表達

11、r>　　SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞CD44、CD90均呈陽性表達，而CD34、CD45呈陰性表達。
　　3.BMSCs成骨成脂誘導(dǎo)分化鑒定
　　經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)分化后，分別用茜素紅染色和油紅O染色均呈陽性。
　　結(jié)論：
　　全骨髓貼壁培養(yǎng)法操作步驟簡單，能夠大量分離、純化、擴增骨髓間充質(zhì)干細胞，獲得的細胞具有骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性，經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后有成骨和成脂分化潛能。
　　第二部分 Evi1基

12、因在骨髓干細胞成脂分化中的表達
　　目的：
　　在體外通過成熟的骨髓間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)其成脂分化，使用PCR和Western blotting方法檢測Evi1基因的表達。
　　方法：
　　1.細胞
　　傳至第3代全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取的骨髓間充質(zhì)干細胞。
　　2.引物設(shè)計與合成
　　引物設(shè)計與合成由大連寶生物公司協(xié)助完成。
　　3.骨髓間充質(zhì)干細胞體外成脂誘導(dǎo)分化
　　細胞接

13、種于60mm培養(yǎng)皿中48小時，然后加入含200μM吲哚美辛，1μM地塞米松，0.5mM IBMX,和0.5μg/ml胰島素的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，每周更換兩次培養(yǎng)基。正常骨髓干細胞為對照組。
　　4. Real-time PCR測定Evi1基因的表達
　　在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后連續(xù)10天中每日提取細胞總RNA，按照說明書將提取的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成cDNA,加入到1μl cDNA與上游引物、下游引物、

14、水及SYBR? Premix Ex Taq在CFX96?Real-Time PCR儀上進行擴增，記錄Ct值、擴增曲線以及溶解曲線。并相對定量計算實驗結(jié)果（2-ΔΔCT法）。
　　5. Western blotting測定Evi1基因的蛋白含量
　　在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后連續(xù)10天中每日提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠，上樣（上樣量均為25μg/孔）、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、經(jīng)過一抗、二抗反反應(yīng)后，

15、進行化學(xué)發(fā)光，利用Image J軟件進行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除去內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表樣品的目的蛋白的相對含量。
　　結(jié)果：
　　與正常培養(yǎng)的骨髓干細胞相比，Evi1基因在骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化前五天存在一過性高表達，并在第三天達到高峰。
　　結(jié)論：
　　通過成熟的骨髓干細胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)方法成功誘導(dǎo)干細胞的成脂分化，并在這一過程中運用Real-time PCR和Western

16、 blotting分別從Evi1基因mRNA和蛋白水平進行檢測，驗證了本本實驗的第一個假設(shè)。為下一步實驗的進行奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分腺病毒載體構(gòu)建以及Evi1基因在骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分中的作用
　　目的：
　　以腺病毒為載體，體外構(gòu)建Evi1基因的干擾質(zhì)粒，對骨髓干細胞進行轉(zhuǎn)染并檢測細胞的轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后對骨髓間充質(zhì)干細胞成脂、成骨分化的影響。為基因治療骨質(zhì)疏松探索新的藥物靶點。
　　方法：
　　1.

17、干擾序列的設(shè)計與合成
　　大鼠Evi1的mRNA序列（Gene Accession No.：NM_001106423.1），分別針對第149和1423位點為起點人工合成2條siRNA序列，綠色熒光蛋白序列作為陰性對照。
　　2.重組腺病毒的構(gòu)建與包裝
　　選擇限制性內(nèi)切酶（BgL2和HindIII）將上述目的片斷定向克隆入穿梭載體pAd-Track-U6；挑取較小的克隆，接種到含卡那霉素的5ml LB液體培養(yǎng)基中，25

18、0轉(zhuǎn)/分鐘，37℃培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒；提取的穿梭質(zhì)粒用PmeI對陽性質(zhì)粒進行線性化，通常酶切過夜；電轉(zhuǎn)化重組，取線性化的穿梭載體與腺病毒骨架載體充分混合，然后加入到電轉(zhuǎn)杯中，放入電轉(zhuǎn)儀進行電轉(zhuǎn)化；挑取較小的單克隆，10到15個，接種到含卡那霉素的5ml液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜；提取質(zhì)粒，選取3到4個質(zhì)粒進行酶切，用PacI進行酶切，然后電泳檢測篩選陽性質(zhì)粒；將鑒定正確的質(zhì)粒按照Lipofectmine2000轉(zhuǎn)染試劑要求，轉(zhuǎn)染293A

19、細胞，收集細胞及培養(yǎng)液反復(fù)凍融后2000g離心收集上清；再次感染293A細胞，重復(fù)這一過程以增加病毒滴度；濃縮、純化重組腺病毒；透析純化病毒懸液；測定重組腺病毒的滴度。
　　3.轉(zhuǎn)染BMSCs
　　取生長良好的傳至第3代的骨髓間充質(zhì)干細胞接種于60mm培養(yǎng)皿中等細胞生長至80％融合時，更換無血清L-DMEM培養(yǎng)基后12小時加入適量的病毒，6-8小時后更換為骨髓間充干質(zhì)細胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，24小時后在倒置熒光顯微鏡下觀察到大量

20、綠色熒光。
　　4.通過Real-time PCR測定干擾效率
　　在成功轉(zhuǎn)染后3天提取RNA，同時提取正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的RNA作為對照組，按照說明書將提取的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成cDNA，在Real-time PCR儀上進行擴增，記錄Ct值、擴增曲線以及溶解曲線。并相對定量計算實驗結(jié)果（2-ΔΔCT）。
　　5. Real-time PCR測定RNA干擾對骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化的影

21、響
　　分別在成功轉(zhuǎn)染后1、3、5和7天提取各組細胞的RNA，同時提取正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞的RNA作為對照組，按照說明書將各組的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成cDNA后，在Real-time PCR儀上進行擴增，記錄Ct值、擴增曲線以及溶解曲線。并相對定量計算實驗結(jié)果（2-ΔΔCT）。
　　6. Western blotting測定RNA干擾對骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化的影響
　　分別在成功轉(zhuǎn)染后1

22、、3、5和7天提取各組細胞的蛋白，BCA測定蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、經(jīng)過一抗、二抗反應(yīng)后，進行化學(xué)發(fā)光，利用Image J軟件進行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除去內(nèi)參β-actin的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表樣品的目的蛋白的相對含量。
　　結(jié)果：
　　1.干擾序列的設(shè)計與合成
　　針對大鼠Evi1的mRNA序列（Gene Accession No.：NM_001106423

23、.1），人工合成2條siRNA序列，分別對5’-GGAAGCAACATGGAAACAA-3’位點進行干擾的siEvi1-1：正鏈5’-GATCCGGAAGCAACATGGAAACAATTCAAGAGATTGTTTCCATGTTGCTTCCT TTTTTG-3’，反鏈5’-AGCTCAAAAAAGGAAGCAACATGGAAACAATCTCTTGAATTGTTTCCATGTT GCTTCCG-3’；和對5’-GCAGTGAGGTCTGCC

24、ATAA-3’位點進行干擾的siEvi1-2：正鏈5’-GATCCGCAGTGAGGTCTGCCATAATTCAAGAGATTATGGCAGACCTCACTG CTTTTTTG-3’，反鏈5’-AGCTCAAAAAAGCAGTGAGGTCTGCCATAATCTCTTGAATTATGGCAGAC CTCACTGCG-3’。
　　2.腺病毒干擾載體的構(gòu)建與作用
　　實驗成功構(gòu)建了異位病毒整合位點的腺病毒干擾載體，而且對骨髓間充質(zhì)

25、干細胞感染效率高達95%，干擾效率分別達到了90.9%和72.3%。
　　3. RNA干擾對骨髓間充質(zhì)干細胞成脂分化的影響
　　分別用Real-time PCR和Western blotting對各組1、3、5和7天的成骨分化的標志物BSP、OCN和OPN以及成脂分化的標志物PPARγ2和LPL進行檢測，結(jié)果顯示：RNA干擾后細胞成脂分化的標志物明顯降低而細胞成骨分化的標志物明顯升高。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建異

26、位病毒整合位點的RNA干擾的腺病毒載體；成功轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞，并且具有很高的干擾效率。驗證了本實驗的第二個假設(shè)，為下一步實驗提供了基礎(chǔ)。
　　第四部分 ShEvi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞緩減大鼠骨質(zhì)疏松的作用
　　目的：
　　建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，在大鼠造模后7天將ShEvi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞通過尾靜脈注謝的方法移植入骨質(zhì)疏松模型大鼠體內(nèi)，注射后28天通過比較各組的骨密度(BMD)、I型骨膠原N-末端前肽（

27、PINP）、I型膠原羥基未端肽（β—CTX）、和股骨生物力學(xué)指標的變化，初步得出RNAi骨髓間充質(zhì)干細胞能夠有效緩解骨質(zhì)疏松進程。
　　方法：
　　1.實驗動物
　　8周健康雌性Sprague Dawley（SD）大鼠40只，體重220-250g，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實驗中心提供。分為四組進行實驗。
　　2.建立大鼠脊髓損傷模型
　　骨質(zhì)疏松模型：實驗動物5%水合氯醛麻醉（0.6ml/100g,腹腔注射

28、）；然后采用腰椎后側(cè)正中切口，椎旁純性分離肌肉組織，切開腹膜，進入腹腔。完整摘除雙側(cè)卵巢，給予傷口徹底的止血，逐層進行縫合，假手術(shù)組手術(shù)操作同上，僅摘除卵巢周圍少許脂肪組織。
　　3.尾靜脈注射ShEvi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞治療骨質(zhì)疏松
　　在骨質(zhì)疏松模型后7天，通過尾靜脈注射的方法將ShEvi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞移植入大鼠骨質(zhì)疏松模型體內(nèi)，對照組分別注射正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞和L-DMEM培養(yǎng)基。
　　4

29、. ShEvi1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細胞治療骨質(zhì)疏松的檢測
　　4.1、血清學(xué)測定
　　大鼠尾靜脈注射治療后28日，取各組大鼠血液5ml離心后取血清用試劑盒對成骨標志物和破骨標示物進行檢測。
　　4.2、骨密度測定
　　使用雙能光子骨密度儀測量整個股骨干的骨密度。
　　4.3、生物力學(xué)測定
　　取雙側(cè)股骨分別進行三點彎試驗試驗。
　　5.統(tǒng)計處理
　　實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（Mean± SD

30、）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功
　　本實驗采用切除大鼠雙側(cè)卵巢這一成熟經(jīng)典造模方法，術(shù)后手術(shù)組大鼠較其它組體重增加，術(shù)后切口無感染，所有大鼠均存活。
　　2.血清學(xué)測定結(jié)果
　　使用上?？泼羯锟萍加邢薰镜膃lisa試劑盒對大鼠骨生成指標Ⅰ型膠原N端前肽和大鼠骨吸收指

31、標β骨膠原交聯(lián)進行檢測，結(jié)果顯示：各組之間差異明顯，治療組優(yōu)于模型組，統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異；RNAi組優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細胞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.骨密度測定結(jié)果
　　使用雙能光子骨密度儀測量股骨的骨密度結(jié)果顯示：兩治療組的骨密度較模型組有明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，RNAi組優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細胞組；但均低于正常對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.生物力學(xué)結(jié)果
　　三點彎試驗結(jié)果顯示：兩治療組生物力學(xué)測定值高于骨