綿羊骨髓抗菌肽（SMAP-29）在畢赤酵母中表達的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、抗菌肽是廣泛存在于自然界生物體中的多肽,是生物體先天免疫的重要組成部分。因其具有抗菌活性強、廣譜抗菌、熱穩(wěn)定性及不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點而廣受人們的關注。 綿羊骨髓抗菌肽(SMAP-29)是1995年Bagella和Margherita Zanetti等研究小組在綿羊的骨髓mRNA中發(fā)現(xiàn)的,具有兩親性α-螺旋結構域,屬于cathelicidins家族,含29個氨基酸殘基,有很強的抗細菌、真菌、中和內(nèi)毒素等生物學功能。 本研究

2、以GenBank發(fā)表的SMAP-29基因(L46854)為模板,參照畢赤巴斯德酵母(Pichia pastotls)密碼子偏好性,設計合成了抗菌肽SMAP-29成熟肽目的基因片段。通過基因重組的方法將合成的基因克隆入pPIC3.5K載體中構建重組酵母胞內(nèi)表達載體pPIC3.5K-SMAP-29,經(jīng)酶切分析、PCR和測序鑒定證明載體構建成功。將構建成功的載體電擊轉化至畢赤酵母受體菌GS115中,經(jīng)G418篩選高拷貝轉化子,并用MM、MD板

3、和PCR法篩選Mut+表型。對構建好的重組酵母表達基因工程菌用甲醇誘導表達,裂解酵母細胞進行Tricine-SDS-PAGE分析,結果在誘導至第2天的細胞裂解液中檢測到與預測的SMAP-29分子量相當,約為3.2KD的表達帶。Trizol法提取酵母總RNA,通過RT-PCR擴增SMAP-29 mRNA,發(fā)現(xiàn)表達期的酵母細胞中存在SMAP-29 mRNA,而對照沒有檢出,表明SMAP-29在畢赤酵母中存在表達。表達產(chǎn)物經(jīng)凝膠過濾色譜處理后

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