肉蓯蓉多糖脂質(zhì)體制備及對雞新城疫苗免疫效果影響的研究.pdf

1、肉蓯蓉多糖(Polysaccharide of Cistanche deserticola，CDPS)是從植物肉蓯蓉中提取的一類高分子活性物質(zhì)，其可增強巨噬細胞吞噬功能、提高血清溶血素值，同時還具有單獨或協(xié)同ConA、PHA促進小鼠胸腺淋巴細胞增殖、脾臟淋巴細胞分泌IL-2的能力，顯示出廣泛的免疫調(diào)節(jié)功能。但將CDPS作為一種免疫增強劑直接用于獸醫(yī)臨床，存在著體內(nèi)代謝較快、作用時間較短、使用成本較高等不足之處。脂質(zhì)體作為一種人工合成的藥

2、物靶向載體，對所載藥物具有緩釋、靶向沉積于網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的特性，能延長藥物的作用時間、提高生物利用效率及藥物定向作用于免疫系統(tǒng)的強度。本課題利用脂質(zhì)體包封技術，將CDPS制備成一種新型的免疫增強劑即肉蓯蓉多糖脂質(zhì)體，通過均勻試驗設計原理，篩選出制備CDPS脂質(zhì)體的最佳工藝參數(shù)，并以目前仍嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)發(fā)展的病毒性傳染病雞新城疫(Newcastle Disease,ND)為研究對象，探討CDPS脂質(zhì)體對ND疫苗免疫效果的影響，并從

3、細胞免疫、體液免疫、免疫調(diào)節(jié)因子(IL-2、IL-4、IFN-γ)活性變化方面，研究CDPS脂質(zhì)體增強肉雞免疫機能的可能機制。主要研究內(nèi)容及結果如下： 1.三種方法提取肉蓯蓉多糖的比較研究 分別采用水提醇沉法、超聲法、超聲結合水提法提取肉蓯蓉多糖，胰蛋白酶-Sevag法除去蛋白，利用molish鑒別反應、碘一碘化鉀反應、多糖水解反應鑒定提取物是否主要為多糖類物質(zhì)，蒽酮-硫酸比色法測定提取物中多糖的含量。結果三種方法的提取

4、物主要均為多糖，其得率分別為1.93％、2.28％、6.06％，純度分別為65.7％、74.3％、81.2％，說明超聲結合水提法提取肉蓯蓉多糖效果最好。 2.均勻試驗設計法優(yōu)化肉蓯蓉多糖脂質(zhì)體制備工藝研究 采用逆向蒸發(fā)法制備CDPS脂質(zhì)體，透析處理后利用蒽酮-硫酸比色法測定包封率，并以其為CDPS脂質(zhì)體質(zhì)量的主要評價指標。根據(jù)均勻試驗設計原理，按照U*6(64)均勻設計表設計試驗方案，探討大豆卵磷脂與氯仿的比例、膽固醇與

5、大豆卵磷脂的比例、肉蓯蓉多糖與大豆卵磷脂的比例、磷酸鹽緩沖液PH值4個因素(每個因素6水平)對包封率的影響。結果，四個因素分別為7％、1∶5、1∶14、6.6時，CDPS脂質(zhì)體平均包封率最高，達68.13％，RSD值僅為2.51％，且在此條件下制備的CDPS脂質(zhì)體在4℃、避光保存120天內(nèi)，PH值基本穩(wěn)定，雖有分層現(xiàn)象出現(xiàn)，但保存120天時包封率仍達50.15％。 3.肉蓯蓉多糖脂質(zhì)體對雞ND苗免疫效果的影響研究 選擇2

6、0日齡健康羅曼肉公雞60只隨機分為4組，即CDPS脂質(zhì)體(I)、CDPS(II)、脂質(zhì)體(Ⅲ)和生理鹽水(IV)組，當試驗雞血清HI抗體效價低于310g2時肌肉注射免疫ND苗，同時，I組肌肉注射5mg/ml的CDPS脂質(zhì)體(500μl/只)、II組肌肉注射50mg/ml的CDPS(2001μl/只，CDPS含量為I組的4倍)、Ⅲ組肌肉注射空白脂質(zhì)體(500μl/只)、Ⅳ組肌肉注射生理鹽水(500μl/只)。分別于免疫前及免疫后第10、2

7、0、30天時，翅靜脈采血收集血清，測定其HI抗體效價及IgG含量，同時對免疫后30天時所收集血清進行雞胚中和保護試驗。結果免疫后10天時，試驗組及對照組HI抗體效價明顯升高；免疫后20天時，I組極顯著高于生理鹽水對照組(P<0.01)，略高于II、Ⅲ組；免疫后30天時，四組血清HI抗體效價均呈降低趨勢，但I組顯著高于II組和Ⅳ組(P<0.05)，與空白脂質(zhì)體組無顯著著異(P>0.05)；免疫雞血清IgG含量變化趨勢顯示：免疫后10天時，

8、I組IgG水平較其它組略高，但各組間無顯著差異(P>O.05)，I組免疫后第20、30天，II、Ⅲ組免疫后第30天時，血清IgG水平均極顯著地高于對照組(P<0.01)，免疫后30天時，I組還極顯著高于CDPS、空白脂質(zhì)體組(P<0.01)，I組免疫后10天至30天時，血清IgG水平呈逐漸升高趨勢，其它組免疫后10天至20天時，血清IgG水平呈升高趨勢，但至30天時，血清IgG水平開始下降；中和試驗結果顯示：CDPS脂質(zhì)體組雞胚死亡率明

9、顯低于CDPS、空白脂質(zhì)體及生理鹽水組，中和指數(shù)以CDPS脂質(zhì)體組最高。結果說明，CDPS脂質(zhì)體對肉雞免疫機能的促進作用最強。 4.肉蓯蓉多糖脂質(zhì)體對雞免疫ND苗后血液中T淋巴細胞、IL、IFN活性的影響研究 在對肉雞進行ND苗抗體檢測的同時，于免疫后15天，每組隨機取6羽，翅靜脈無菌采集抗凝血，采用酸性α-乙酸萘酯酶染色試驗(ANAE)和淋巴細胞轉化試驗(MTT法)分別測定T淋巴細胞ANAE陽性率及增殖活性。免疫后20

10、天時，每組隨機取8羽翅靜脈采血分離血清，采用ELISA方法測定血清中細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ的含量。結果表明，淋巴細胞轉化率在四組間無顯著差異(P>0.05)，淋巴細胞ANAE陽性率在I、II、Ⅲ組間無顯著差異(P>O.05)，但I、II組顯著高于對照組(P<0.05)；IL-2含量以CDPS脂質(zhì)體組和脂質(zhì)體組較高，均極顯著高于CDPS組和生理鹽水對照組(P<0.01)，CDPS脂質(zhì)體組IL-4含量極顯著高于其它三組(P<