禽致病性大腸桿菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突變株的構建及其相關功能性分析.pdf

1、禽大腸桿菌病是由禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的一種常見的重要細菌性傳染病，且易與其它病原性細菌、病毒并發(fā)或混合感染，給世界范圍內養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經濟損失。 研究發(fā)現(xiàn)，與禽大腸桿菌毒力相關的致病因子主要有：I型菌毛、P型菌毛、卷曲菌毛、鐵轉運系統(tǒng)、K抗原、補體抗性等。在上述大腸桿菌諸多致病因子中，菌毛對病原性大腸桿菌在易感動物機體內的入侵、定居、增殖或釋放毒

2、力因子的感染和致病過程中起著重要的作用。95％雞致病性大腸桿菌菌株均可表達I型菌毛，I型菌毛是菌體復合蛋白，由主要結構亞單位FimA和3個次要亞單位FimF、FimG及FimH組成。在I型菌毛的組成中，位于菌毛項部的粘附蛋白FimH，是I型菌毛和D-甘露糖受體特異性結合的粘附素(adhesin)，因此I型菌毛又稱甘露糖敏感性菌毛。 為探討I型菌毛特別是FimH在禽大腸桿菌病發(fā)病過程中起的作用，基于禽大腸桿菌I型菌毛黏附素fimH

3、基因的已知序列，利用九噬菌體Red重組系統(tǒng)對禽致病性大腸桿菌國內分離株A2(血清型O2:K89)、CEl28(血清型O78:K89)、CEl29(血清型O1:K89)和1株禽源非致病性大腸桿菌C1(健康雛雞腸道分離株，血清型未鑒定)I型菌毛上的黏附fimH基因進行敲除。其主要構建步驟為：首先PCR擴增出兩翼與fimH基因上下游序列同源，中問為氯霉素抗性基因的DNA片段，然后轉化入A2、CEl28 CEl29和C1，在Red重組系統(tǒng)表達重

4、組酶的幫助下，含氯霉素抗性基因的PCR產物通過其兩側的fimH基因同源序列與禽大腸桿菌染色體上的fimH基因發(fā)生同源重組，通過氯霉素抗性平板篩選得到陽性克隆，對篩選得到的陽性克隆再導入編碼Flp重組酶的質粒pCP20，通過第二次重組去除抗性基因，結合PCR擴增和測序鑒定，證明△fimH突變株A2△fimH、CEl28△fimH、CEl29△fimH、C1△fimH正確構建。由于△fimH突變株染色體上的fimH基因序列大部分已缺失，從而

5、造成回復突變的可能性不大?；?株△fimH突變株構建的基礎上，比較分析了4株△fimH突變株和其野生菌株的體外細胞粘附特性和其它部分相關生物學特性。通過豚鼠紅細胞和酵母細胞凝集試驗結果表明，所有野生株呈現(xiàn)良好的凝集效果，并能被0.5％甘露糖溶液完全抑制，而所有的△fimH突變株未呈現(xiàn)任何凝集現(xiàn)象，進一步通過fimH基因互補試驗使△fimH突變株恢復了與野生株具有相同的凝集活性。豚鼠紅細胞和酵母細胞凝集試驗證明，F(xiàn)imH蛋白是I型菌毛和

6、D-甘露糖受體特異性結合的粘附素，即I型菌毛為甘露糖敏感性菌毛。體外生長試驗結果表明，△fimH突變株生長周期各個階段都要稍慢于野生株。雞嗜異性粒細胞和A549細胞(人肺上皮細胞)粘附試驗表明，相對于野生菌與雞嗜異性粒細胞和A549細胞粘附的數(shù)量來說，△fimH突變株少于野生株。 利用λ噬菌體Red重組系統(tǒng)構建的△fimH突變株染色體上的fimH基因序列大部分已缺失。已構建的4株△fimH突變株與常規(guī)方法構建的突變株相比，其4株