腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血漿差異蛋白質(zhì)分析.pdf

1、背景:
　　膠質(zhì)瘤是由神經(jīng)外胚層分化而來(lái)的膠質(zhì)細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞等）所形成的腫瘤，是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。膠質(zhì)瘤發(fā)病率占惡性腦腫瘤的80％。它的治愈率隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而逐步降低。惡性程度最高的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOⅣ級(jí))患者的平均生存時(shí)間只有12-15個(gè)月。這與其他腫瘤治療后5-10年的中位生存期相比差距太大。此外，膠質(zhì)瘤很容易復(fù)發(fā)，且復(fù)發(fā)時(shí)經(jīng)常伴有腫瘤惡性等級(jí)的升高，對(duì)放、化療藥物敏感性降低或

2、者耐藥性的產(chǎn)生。
　　目前腫瘤的診斷主要依賴(lài)影像學(xué)和組織病理學(xué)。由于膠質(zhì)瘤影像復(fù)雜、多樣及不典型性，影像學(xué)診斷雖然能夠直觀的顯示腫瘤的存在，但不能明確腫瘤的類(lèi)型及分期。組織病理學(xué)是目前判斷腫瘤類(lèi)型的常規(guī)手段，但組織活檢具有創(chuàng)傷性，難以實(shí)現(xiàn)早期診斷和對(duì)療效的實(shí)時(shí)監(jiān)控。同時(shí)，由于組織病理學(xué)的判斷具有很大的主觀性，不同的病理學(xué)醫(yī)生對(duì)同一標(biāo)本的判讀經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)偏差。如果能夠從外周血中探索出膠質(zhì)瘤特異的蛋白分子，無(wú)疑將可以在預(yù)后判斷、療效評(píng)價(jià)

3、以及復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)等方面提供更多的信息，以協(xié)助臨床醫(yī)生更好的實(shí)現(xiàn)患者的個(gè)體化治療。
　　患者的外周血標(biāo)本雖然獲取容易，但是血漿中的蛋白質(zhì)很難分離和鑒別，質(zhì)譜技術(shù)在這方面具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用二維凝膠電泳(2DE)結(jié)合超高效納升液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(Nano-UPLC-nano-ESI-MS/MS)，在血漿中能夠分離并鑒定出近2000種蛋白質(zhì)和多肽。這使得從血漿中篩選出膠質(zhì)瘤特異性的標(biāo)志蛋白成為可能。
　　目的:
　　本研

4、究應(yīng)用比較蛋白質(zhì)組技術(shù)，通過(guò)對(duì)原發(fā)性腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人和健康人血漿蛋白質(zhì)組的分離、分析和比較，尋找腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤特異性的血漿蛋白標(biāo)志物。為腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)理的闡明、靶向治療藥物的篩選和研發(fā)，以及腦膠質(zhì)母細(xì)胞病人的早期診斷、預(yù)后判斷、治療方案選擇、療效評(píng)價(jià)、復(fù)發(fā)檢測(cè)提供有意義的幫助。
　　方法:
　　從原發(fā)腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病人與健康體檢者空腹血漿標(biāo)本中分別隨機(jī)盲選出6例標(biāo)本。先應(yīng)用Bradford法測(cè)蛋白質(zhì)含量，并去除非蛋白

5、質(zhì)組分。再采用二維凝膠電泳(2DE)技術(shù)分離差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，凝膠銀染色后用BIO-RAD GS-800凝膠成像儀掃描圖像。獲得的圖像經(jīng)PDQuest Advanced-8.0.1分析軟件分析出差異超過(guò)2倍的差異點(diǎn)。差異點(diǎn)經(jīng)過(guò)膠內(nèi)酶切，應(yīng)用超高效納升液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(NanoUPLC-nano-ESI-MS/MS)技術(shù)分離鑒定。經(jīng)軟件PLGS v2.3處理后應(yīng)用Mascot軟件按照MS/MS離子方式檢索IPI(Internation

6、alProtein Index)Database數(shù)據(jù)庫(kù)。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)的比較分析篩選并鑒定出表達(dá)差異的蛋白質(zhì)。
　　結(jié)果:
　　通過(guò)2DE分離兩組血漿蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)軟件分析，共篩選出表達(dá)量差異大于兩倍的4個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)。經(jīng)過(guò)NanoUPLC-nano-ESI-MS/MS質(zhì)譜分離并鑒定，Mascot軟件分析數(shù)據(jù)，得到23個(gè)表達(dá)上調(diào)的差異蛋白質(zhì)。包括兩個(gè)未命名蛋白質(zhì);人血清白蛋白R(shí)218h突變體與甲狀腺素復(fù)合物A鏈;人血清白蛋白與肉豆蔻

7、酸鹽、阿扎丙宗結(jié)合物A鏈;人血清白蛋白與肉豆蔻酸鹽、阿司匹林結(jié)合物A鏈;載脂蛋白D;載脂蛋白前蛋白原;補(bǔ)體C3;溶菌酶前體;第77位氨基酸由半胱氨酸突變?yōu)楸彼岬娜巳芫窤鏈;第96位和109位氨基酸雙突變的人溶菌酶;S100蛋白-A7; S100蛋白-A8;人谷氨酸脫羧酶65單克隆抗體;與疾病有關(guān)的抗人細(xì)胞集落刺激因子自身抗體;組織相容性符合物人類(lèi)白細(xì)胞抗原A-A1抗多肽/黑色素瘤抗原A1單克隆抗體;與人白介素15結(jié)合的抗白介素15抗

8、體;本周氏蛋白;IGL@protein;人Toll3受體四元復(fù)合物結(jié)合3個(gè)Fab片段;神經(jīng)存活因子（抗菌肽）前蛋白原;抗菌肽2抗菌變體;血小板堿性蛋白前蛋白原。
　　結(jié)論
　　本研究首次應(yīng)用了成熟靈敏的二維凝膠電泳技術(shù)，和最先進(jìn)的Nano UPLC-nano-ESI-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)。對(duì)膠質(zhì)瘤中惡性程度最大的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤血漿標(biāo)本進(jìn)行鑒定。本次共篩選出23個(gè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤與健康人具有差異的血漿差異蛋白。他們可能共同參與了膠質(zhì)母