特應性皮炎皮膚屏障功能障礙與Thl-Th2型細胞因子相關指標的關聯(lián)研究.pdf

1、特應性皮炎(Atopic dermatitis,AD)是一種常見的慢性復發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病,近年來世界范圍內發(fā)病率呈快速上升趨勢。AD發(fā)病機制尚不完全清楚,可能為遺傳背景、免疫系統(tǒng)平衡失調、皮膚屏障功能障礙以及環(huán)境因素等共同作用的結果。遺傳免疫異常及皮膚屏障功能障礙是當前AD發(fā)病機制的研究熱點。
　　 AD免疫反應異常主要表現(xiàn)為Th1/Th2功能的失調,表現(xiàn)為高水平IgE的產生,肥大細胞的過度活化,以及皮膚內樹枝狀細胞的

2、異常信號介導等。Th1/Th2功能失衡引起細胞因子分泌異常在AD的不同時期皮損內表達水平有差異。急性期皮損以Th2型免疫反應為主,白細胞介素(Interleukin,IL)4、13呈優(yōu)勢表達;而慢性期皮損則Th1型免疫反應明顯增強,干擾素(Interferon,IFN)γ呈相對優(yōu)勢表達。
　　 AD患者存在廣泛的皮膚屏障功能障礙,并與炎癥的嚴重程度呈正比。表皮屏障功能障礙主要表現(xiàn)為皮膚終生干燥,角質層細胞(stratum cor

3、neum,SC)水合度下降,透皮水丟失(Transepidermal.water loss,TEWL)明顯增高,SC細胞間黏附性下降,過度脫屑等。屏障功能障礙可使外界抗原及病原體表皮通過性增高,進而誘發(fā)免疫及皮膚屏障功能的進一步損傷。
　　 絲聚合蛋白(Filaggrin,FLG)由定位于人1q21位點上FLG基因編碼,是正常表皮末端分化及維持皮膚水合度的關鍵蛋白,是維持表皮屏障功能完整性的重要蛋白。Profilaggrin形成

4、于顆粒層透明角質顆粒,FL6單體依賴轉谷胺酰酶(Transglutaminases,Tgases)交連聚集角蛋白中間絲,為SC細胞角質包膜(cornified envelope,CE)提供緊密的骨架系統(tǒng)。FLG水解后產生的酸性終產物是皮膚天然保濕因子(natural moisturizing factor,NMF)活性成分的主要來源并是維持角質層弱酸性環(huán)境的主要因素之一。FLG功能的發(fā)揮及降解代謝過程涉及多種酶類及離子信號。在鈣離子濃度

5、增高的情況下,profilaggrin被脫磷酸化并進一步經絲氨酸蛋白酶(serine protease,SP)水解。這些SPs主要包括matriptase,通道活化的絲氨酸蛋白酶1(channel-activating serine protease,CAP1),角質層糜蛋白酶(stratum corneum chymotryptic enzyme/SCCE,又稱kallikrein7/KLK7)及角質層胰蛋白酶(stratum cor

6、neum tryptic enzymes/SCTE,又稱kallikrein5/KLK5)分解profilaggrin釋放出多拷貝的功能性FLG重復肽片段單位,為CE提供骨架系統(tǒng)構成成分。并最終在半胱氨酸基天冬氨酸特異性蛋白酶14(caspasel4)作用下產生具有吸濕性的降解產物游離氨基酸及尿刊酸(urocanic acid,UCA),吡咯烷酮羧酸(pyrrolidone carboxylic acid,PCA),構成NMF的主要組成

7、成分。而由絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal5型基因(serineprotease inhibitor Kazal type5,SPINK5)編碼的淋巴上皮Kazal型相關抑制劑(Lympho-epithelial Kazal-type-related inhibitor,LEKTI)蛋白是調控這些蛋白水解酶活性最重要的抑制劑。
　　 AD皮損中FLG廣泛的低表達已被證實。盡管眾多研究表明不同人種AD患者中FLG的無功能性基因變異普遍

8、存在,是AD皮損中FLG低表達的重要原因,但這些突變僅在不足1/3患者中發(fā)現(xiàn),且具有明顯的遺傳異質性。近年研究發(fā)現(xiàn)Th2/Th1型細胞因子也可明顯影響角質形成細胞(Keratinocyte,KC)FLG的表達,IL4,IL13可降低FLG的表達,IFN-γ可提高FLG的表達。然而發(fā)生這種效應的機制尚不清楚。
　　 有證據表明AD患者TEWL的明顯增高引起機體缺水,全身的水代謝異?？蛇M而導致內分泌改變。日本學者發(fā)現(xiàn)在重度AD患者中

9、存在由于大量TEWL導致的繼發(fā)性抗利尿激素(antidiuretic hormone,ADH)增高。人體調節(jié)水代謝平衡主要是通過ADH來完成,增高的ADH作用于腎集合管主細胞,增加水的重吸收,排出較少量的高滲尿。腎臟集合管細胞上的水通道蛋2(aquaprin-2,AQP-2)是ADH作用于腎臟調節(jié)水重吸收作用的最關鍵的靶蛋白。AQP-2通過穿梭機制使得主細胞對水的重吸收大大增加。慢性限水過程中,AQP-2在腎臟表達增加。生理情況可有少量

10、AQP-2蛋白分子脫落并隨尿液排出體外,并與AQP-2在腎臟表達量呈正相關。我們于體外人KC培養(yǎng)的情況下,添加Th2,Th1型細胞因子模擬AD患者急、慢性皮損免疫異常的模式,采用熒光實時定量PCR及Western Blot方法檢測KC中FLG及其代謝相關酶類的表達變化情況,從而為揭示AD患者表皮屏障功能障礙的發(fā)生機制提供理論依據,也為將來針對AD皮損進行屏障功能調節(jié)治療提供思路。同時通過ELISA方法檢測AD患兒尿液AQP-2(u-AQ

11、P-2)水平的變化,探討u-AQP-2水平與AD疾病嚴重程度的相關性,為評價兒童AD嚴重度尋找新的臨床評價指標。
　　 材料與方法：
　　 一、研究對象：
　　 1、人KC細胞:包括無血清培養(yǎng)的人皮膚角質形成細胞(Normal human keratinocytes,NHK)及HaCaT角質形成細胞株。
　　 2、兒童AD病例組:50例AD患者均為遼寧籍漢族兒童,年齡2月-8歲。男35名,女15名。符合H

12、-R診斷標準。采用客觀特應性皮炎評分指數(shù)(Objective Scoring AtopicDermatitis index,O-SCORAD)確定疾病的嚴重程度,于就診前3個月未系統(tǒng)使用糖皮質激素及免疫抑制劑,就診前2周未使用外用藥。
　　 3、兒童正常對照組:35例健康兒童,年齡性別與病例組相匹配。已排除有過敏性哮喘、過敏性鼻炎及蕁麻疹、濕疹、枯草熱等特應性疾病及家族史的遼寧籍漢族正常兒童。以上兩組研究對象均已排除其他影響水鹽

13、代謝疾病及狀態(tài),簽署知情同意書。
　　 二、實驗材料：角質形成細胞及培養(yǎng)液等相關試劑、實時定量RT-PCR試劑、Western Blot相關試劑、免疫組織化學及ELISA相關試劑。
　　 三、實驗方法：
　　 1、人KC培養(yǎng)方法
　　 (1).NHK無血清培養(yǎng)方法:采用胰蛋白酶-EDTA,冷溫兩步消化法對人包皮皮膚組織進行消化分離,進而進行NHK細胞無血清培養(yǎng),繪制生長曲線,用廣譜單克隆抗角蛋白抗體免疫組

14、織化學(Immunohistochemistry,IHC)方法進行鑒定。
　　 (2).HaCaT角質形成細胞株培養(yǎng)方法:按常規(guī)貼壁細胞培養(yǎng)傳代。
　　 2、檢測人KC在Th2型細胞因子刺激下FLG及其代謝相關酶類在不同鈣離子濃度條件培養(yǎng)下的表達。
　　 (1)、應用實時定量RT-PCR方法檢測KC在IL-4,IL-13刺激下FLG及其代謝相關酶類Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5

15、/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/KLK5mRNA的表達。
　　 (2)、應用Western-blot方法檢測KC在IL-4,IL-13刺激下FLG及其代謝相關酶類Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/KLK5蛋白水平的表達。
　　 3、檢測人KC在Th1型細胞因子刺激下FLG及其代謝相關酶類在不同鈣離子濃度條件培養(yǎng)下的表達。
　　

16、 (1)、應用實時定量RT-PCR方法檢測KC在IFN-γ刺激下FLG及其代謝相關酶類Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/KLK5 mRNA的表達。
　　 (2)、應用Western-blot方法檢測KC細胞在IFN-γ刺激下FLG及其代謝相關酶類Matriptase,CAP1,Caspase-14,SPINK5/LEKTI,SCCE/KLK7,SCTE/

17、KLK5蛋白的表達。
　　 4、檢測兒童特應性皮炎患者尿液中AQP-2水平,評價其與O-SCORAD評分及血液,尿液臨床指標的關系。
　　 (1)、收集兒童AD患者病例,采用O-SCORAD評分評估嚴重度。
　　 (2)、對患兒進行尿液pH(urine pH,u-pH),尿液比重(urine specificgravity,u-SC)及外周血嗜酸性粒細胞計數(shù)(Peripheral blood eosinophil

18、count,EOS),血清總IgE水平的檢測(Serum Imunoglobul in E,s-IgE)。
　　 (3)、ELISA方法對患兒及正常兒童尿液u-AQP-2水平進行檢測,同時檢測尿液肌酐水平(Creatinine,Cr)進行校正。
　　 四、統(tǒng)計學方法：統(tǒng)計學分析過程采用SPSS13.0軟件完成。計量資料采用-x±SD表示。Kolmogorov-Smirnov test法檢驗數(shù)據分布的正態(tài)性,Levene'

19、s Test檢驗各組間方差齊性。統(tǒng)計方法主要包括One-Way ANOVA分析,Student's t-test,Kruskal-Wallis檢驗,Mann-Whitney U檢驗,Pearson's test/Spearman'srank test。P＜0.05具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果
　　 1、Th2型細胞因子對人KC細胞FLG表達代謝的影響
　　 (1)IL-4及IL-13能顯著下調KC細胞FLG、SP

20、INK5/LEKTI表達(P＜0.05);上調Matriptase,CAP1,KLK7表達(P＜0.05)。
　　 (2)增高鈣離子濃度誘導KC分化可顯著上調KC細胞FLG,SPINK5/LEKTI,matriptase,CAP1,KLK7及KLK5表達(P＜0.05)。
　　 2、Th1型細胞因子對人KC細胞FLG表達代謝的影響IFN-γ顯著上調KC細胞FL6、SPINK5/LEKTI,Caspase14的表達(P＜0

21、.05);顯著下調Matriptase,CAP1,KLK7表達(P＜0.05)。
　　 3、兒童AD尿液AQP-2的水平及其與O-SCORAD評分,臨床相關指標的相關性嬰兒期AD患兒u-AQP-2水平明顯增高且與皮膚干燥正相關。而O-SCORAD評分,EOS,s-IgE,u-SG以及性別與兒童AD u-AQP-2水平沒有相關性。
　　 結論：
　　 1、角質形成細胞中FLG及FLG代謝相關酶類的表達,受Th2,T