利用馬鈴薯內(nèi)生菌Bacillus megaterium PE1表達小鼠干擾素-γ和家蠶素Ⅱ的研究.pdf

1、隨著生物科技的進步，植物不僅可以為人類提供傳統(tǒng)的天然產(chǎn)品，而且已成為表達有醫(yī)藥價值或工業(yè)用途的外源蛋白的良好生物反應器，利用植物生物反應器表達外源蛋白，可將外源蛋白富集于種子、塊莖、塊根等組織器官中，有利于蛋白的分離純化。由于植物體表達外源蛋白易進行大規(guī)模生產(chǎn)，產(chǎn)品獲取及加工相對簡單，生產(chǎn)成本較低，因此受到人們的廣泛重視。但目前將外源基因?qū)胫参锏母鞣N方法均有一定的局限性，如操作繁瑣費時、外源基因丟失、基因沉默等。因此，開發(fā)快速、簡便、

2、低成本的外源基因轉(zhuǎn)化方法是研究的重要課題。植物內(nèi)生菌(endophyte)廣泛存在于各種植物組織內(nèi)，與宿主植物長期互惠共生，人類的植食性食物中均含有內(nèi)生菌，說明內(nèi)生菌對人體無害，符合食品安全要求，因此利用轉(zhuǎn)基因內(nèi)生菌在植物體內(nèi)表達外源基因可能是一條有效的途徑。前人利用工程內(nèi)生菌在宿主植物中表達的產(chǎn)物主要是抗蟲蛋白，而大腸桿菌、巨大芽孢桿菌等原核表達系統(tǒng)的開發(fā)則只限于體外培養(yǎng)和表達。為此，本研究從馬鈴薯（Solanum tuberosum

3、）塊莖中分離到一株內(nèi)生細菌巨大芽孢桿菌Bacillus megateriumPE1，并以此菌株作為外源基因表達菌，將小鼠（Mus musculus）干擾素-γ（interferonγ，IFNγ）基因和家蠶（Bombyx mori）的家蠶素Ⅱ(bombyxinⅡ，BBXⅡ)基因?qū)隑acillusmegaterium PE1中，進而再回接至馬鈴薯中，測定了在體外培養(yǎng)及回接到馬鈴薯植株之后2種外源蛋白的表達情況及表達產(chǎn)物的生理活性。本研究的

4、主要目的旨在探討使用相對簡單的原核生物轉(zhuǎn)化手段，繞過植物轉(zhuǎn)化的過程，利用內(nèi)生菌實現(xiàn)外源基因在植物中的表達，從而建立一種植物內(nèi)生菌-宿主植物新型表達系統(tǒng)。主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　(1)對馬鈴薯塊莖中內(nèi)生菌進行了分離、鑒定與優(yōu)勢菌篩選。首先比較了無菌水沖洗、75％乙醇、0.1％氯化汞以及次氯酸鈉幾種不同方法對馬鈴薯塊莖進行表面滅菌的效果，確定用次氯酸鈉溶液效果最佳。對馬鈴薯塊莖中的內(nèi)生菌用LB培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)，共獲得27株內(nèi)生細菌(

5、編號分別為PE1-PE27)。對各菌株進行16S rDNA測序鑒定，將測序結(jié)果于GenBank進行BLAST，利用GenBank上已登錄的序列構建系統(tǒng)進化樹。經(jīng)同源性檢測，分離到的27個菌株分屬于4個屬的7個種，其中芽孢桿菌屬(Bacillus)共有17株，假單胞菌屬（Pseudomonas）有5株，葡萄球菌屬(Staphylococcus)有3株，短狀桿菌屬（Brachybacterium）有2株，芽孢桿菌屬的菌株數(shù)占總分離菌株數(shù)的6

6、3.0％,表現(xiàn)出明顯的種群優(yōu)勢，而在芽孢桿菌屬的17個菌株中，有10株為巨大芽孢桿菌。而且巨大芽孢桿菌作為異源蛋白表達系統(tǒng)已經(jīng)有良好的研究基礎和諸多優(yōu)勢。因此本研究將巨大芽孢桿菌PE1菌株作為表達外源基因的載體菌，定名為“Bacillusmegaterium PE1”。
　　(2)研究了溶菌酶濃度、酶解溫度及酶解時間對Bacillus megaterium PE1原生質(zhì)體形成率及再生率的影響。三種影響因素的單因素試驗結(jié)果表明，三個

7、因素對PE1原生質(zhì)體形成率的影響與對再生率的影響呈相反趨勢。進一步以原生質(zhì)體形成率與再生率的乘積作為考察指標，針對三個因素設計正交試驗以確定最佳的處理條件，結(jié)果顯示，三種主要因子的影響程度依次為:溫度＞時間＞酶量。通過正交試驗確定的Bacillusmegaterium PE1原生質(zhì)體最佳制備條件為:溶菌酶濃度4 mg/mL，酶解溫度30℃，酶解時間90 min。
　　(3)研究了小鼠干擾素-γ基因(mIFN-γ)導入Bacillu

8、s megaterium PE1及其在體外和回接到馬鈴薯植株中的表達情況。首先克隆了小鼠干擾素-γ基因（mIFN-γ）的cDNA，構建了重組表達質(zhì)粒pHIS1522-mIFN-γ，以此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Bacillus megateriumPE1，并用D-xylose誘導mIFN-γ的表達，經(jīng)SDS-PAGE及ELISA檢測均表明，mIFN-γ在Bacillus megaterium PE1中獲得了表達，表達量為224.6229 mg/L。將

9、表達mIFN-γ的Bacillus megaterium PE1菌株回接到馬鈴薯組培苗，回接5d、10d、15d、20 d后分別進行檢測，均檢測到組培苗中有mIFN-γ的存在，說明導入mIFN-γ基因的Bacillusmegaterium PE1菌株能夠在馬鈴薯組培苗中侵染、定殖，并可在馬鈴薯植株內(nèi)表達具有活性的外源蛋白。
　　(4)研究了家蠶素Ⅱ基因（BBX-Ⅱ）導入Bacillus megaterium PE1及其在體外和回接

10、到馬鈴薯植株中的表達情況。首先克隆了家蠶素Ⅱ基因(BBX-Ⅱ)的cDNA，構建了重組表達質(zhì)粒pHIS1522-BBX-Ⅱ，然后轉(zhuǎn)化Bacillus megaterium PE1，篩選攜帶BBX-Ⅱ的陽性菌落，以D-xylose誘導BBX-Ⅱ的表達，SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，BBXⅡ在Bacillus megaterium PE1中獲得了表達。將表達BBXⅡ的Bacillus megaterium PE1菌株回接到馬鈴薯組培苗，回接5

11、d、10d、15d、20 d后分別進行檢測，均檢測到組培苗中存在BBXⅡ，說明導入BBX-Ⅱ基因的Bacillus megaterium PE1菌株能夠在馬鈴薯組培苗中侵染、定殖，并可在馬鈴薯植株內(nèi)表達BBXⅡ。
　　(5)對Bacillus megaterium PE1表達的BBXⅡ進行了純化和生物活性鑒定。首先將Bacillus megaterium PE1表達的BBXⅡ利用親和層析獲得純化的BBXⅡ蛋白，配制BBXⅡ注射液，

12、并處理家蠶和小鼠。結(jié)果表明，BBXⅡ無論對正常家蠶、饑餓后進食的家蠶還是飼喂高糖飼料誘導的高血糖家蠶，均具有降低血液海藻糖含量及提高海藻糖酶活性的作用。Bacillus megaterium PE1表達的BBXⅡ，對正常小鼠和鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠也均有降血糖的生理活性，其效果與胰島素相近。
　　(6)本研究結(jié)果說明，利用馬鈴薯內(nèi)生細菌Bacillus megaterium PE1作為外源基因表達菌，無論在體外還是回接到宿主馬

13、鈴薯植株內(nèi)，均能表達外源基因，獲得具有生物活性的表達產(chǎn)物，因此建立一種植物內(nèi)生菌-宿主植物新型基因工程表達系統(tǒng)是可能的。這種表達系統(tǒng)具有構建過程相對簡單、成本低、內(nèi)生菌在宿主植物體內(nèi)擴散快、用量少、通過常規(guī)無性繁殖方法可傳遞給后代、有些內(nèi)生菌具有多種宿主植物、對人安全無害等諸多優(yōu)勢，如將對人體有益的外源蛋白基因如疫苗、消化道防御性蛋白等導入內(nèi)生菌并使其在植物中表達，人食用之后可以起到藥食兩用的效果，將具有良好的開發(fā)前景。但對于導入外源基