白念珠菌分泌的誘導(dǎo)人單核細(xì)胞凋亡的新因子的初步純化和鑒定.pdf

1、目的:本研究我們將觀察從白念珠菌培養(yǎng)上清液中分離到的一種新型毒力因子分泌型IL-12抑制因子(Secretary IL-12 Inhibitory Factor，SIIF)對(duì)人類單核細(xì)胞增殖率的影響和誘導(dǎo)凋亡情況，檢測其誘導(dǎo)凋亡活性。觀察SIIF蛋白結(jié)合于人類單核細(xì)胞的部位。明確SIIF的蛋白序列和基因序列，篩選出可疑蛋白，有助于后期SIIF蛋白作用機(jī)制的研究及將來有可能采取特異性干擾SIIF蛋白活性的治療方案來控制局部及系統(tǒng)性的白念珠

2、菌感染。
　　方法:白念珠菌菌株選自前期試驗(yàn)中收集念珠菌性陰道炎(vulvovaginal candidiasis，VVC)患者陰道分泌物經(jīng)直接鏡檢、接種培養(yǎng)形態(tài)學(xué)鑒定及提取DNA檢索基因組數(shù)據(jù)庫均鑒定為白念珠菌的菌株。人類單核細(xì)胞選用人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(The Human acutemonocytic leukemia cell line，THP-1)。將選定的白念珠菌接種于含有20mlRPMI1640培養(yǎng)液的離心管中，

3、置于37度恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，經(jīng)兩次純化后接種于含有500mlRPMI1640液體培養(yǎng)基燒瓶中，繼續(xù)37度恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)后收集培養(yǎng)上清液，分裝入離心管中離心除去白念珠菌，離心后的上清液經(jīng)除菌濾過器(0.22μ m)再次除菌，將培養(yǎng)上清液加入Centricon-70蛋白濃縮器（截留分子量大于30KDa的蛋白分子）中離心濃縮得到SIIF蛋白，BCA法測定蛋白濃度后-80度保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)根據(jù)是否在培養(yǎng)的人單核細(xì)胞中加入

4、SIIF蛋白分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組SIIF蛋白終濃度為400μg/ml。SIIF蛋白與THP-1細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)后GENMED XTT法分別檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組450nm波長處吸光度值并根據(jù)吸光度值計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組相對(duì)對(duì)照組細(xì)胞增殖率;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)分別檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組THP-1細(xì)胞早期凋亡率;ConA-FITC/DAPI雙染法熒光顯微鏡觀察SIIF蛋白結(jié)合于

5、細(xì)胞部位;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離純化SIIF蛋白，電泳后的SDS-PAGE條帶經(jīng)胰蛋白酶酶解后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatography-tandem massspectrometric，LC-MS/MS)分析，然后采用Mascot軟件檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫獲得

6、與肽段匹配的相關(guān)蛋白及其基因序列，最后根據(jù)蛋白分子量大小、評(píng)分及相關(guān)功能綜合評(píng)價(jià)篩選出可疑蛋白。測得的THP-1細(xì)胞增殖率及細(xì)胞早期凋亡率應(yīng)用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:1.GENMEDXTT法檢測顯示SIIF蛋白作用于THP-1細(xì)胞24小時(shí)后，450nm處吸光度值明顯低于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)對(duì)照組細(xì)胞增殖率也明顯低于對(duì)照組，與對(duì)照組細(xì)胞增殖率相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026＜0.05)。2.Annexi

7、nⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測顯示SIIF蛋白作用于THP-1細(xì)胞24小時(shí)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早期凋亡率為(11.867±1.604)％，明顯高于對(duì)照組(5.300±0.265)％，與對(duì)照組早期凋亡率相比較差異具有顯著性意義(P=0.002＜0.01)。3.ConA-FITC/DAPI雙染熒光顯微鏡觀察顯示，SIIF蛋白所在位置的綠色熒光與DAPI所在細(xì)胞核位置的藍(lán)色熒光完全重合，說明SIIF蛋白進(jìn)入THP-1細(xì)胞后結(jié)合于細(xì)胞核。4.

8、SIIF蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離、胰蛋白酶酶解及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析后，根據(jù)蛋白分子量大小、評(píng)分及功能綜合評(píng)價(jià)后，我們將分泌型天冬氨酸蛋白酶6(Secretedaspartyl proteinase, Sap6)和Rbt4p(repressed by TUP1 protein4)兩種蛋白作為SIIF候選蛋白。
　　結(jié)論:1.SIIF蛋白能抑制THP-1細(xì)胞增殖。2.SIIF蛋白具有誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡的活性。3.SIIF蛋