小麥近等基因系白粉病抗性反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、小麥白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麥?；虰lumeria graminis f.sp.tritici(Bgt)引起的氣傳性病害。在我國，自從上世紀(jì)80年代以來兩次白粉病大流行后，小麥白粉病的發(fā)病面積與發(fā)病程度均維持在一個(gè)較高水平，嚴(yán)重影響我國小麥的籽粒品質(zhì)與產(chǎn)量，已成為我國小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、高效、優(yōu)質(zhì)的主要制約因素之一。由于在較短時(shí)間內(nèi)小麥白粉病菌就能突變成新的生理小種并且含單一抗性基因品種會(huì)在短期內(nèi)抗性減弱甚至喪失，因此了解小麥在感染病

2、菌后的信號(hào)傳導(dǎo)及響應(yīng)對(duì)于科學(xué)家揭露抗病分子機(jī)制以及作物育種有巨大的幫助。
　　本研究以高感白粉病菌生理小種E09小麥品種Chancellor及其近等基因系(NIL)L031（高抗）與兩者雜交后代F1（高抗）為研究對(duì)象，采用RNA-seq技術(shù)對(duì)小麥白粉病菌E09分別誘導(dǎo)16h和96h后的Chancellor、L031與F1幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，通過差異表達(dá)基因的篩選與注釋，從轉(zhuǎn)錄組水平上分析抗感病小麥材料對(duì)白粉病菌不同的防御反應(yīng)以及早

3、期病程相關(guān)基因的表達(dá)。主要結(jié)果如下:
　　(1) RNA-seq轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與從頭組裝及注釋
　　對(duì)白粉菌侵染16h和96h后三個(gè)小麥材料L031，F(xiàn)1以及Chancellor各自的混合樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到六個(gè)轉(zhuǎn)錄組，包括T1，T2和T3(分別代表L031-16h，F(xiàn)1-16h以及Chancellor-16h);以及T4，T5和T6(分別代表L031-96h，F(xiàn)1-96h以及Chancellor-96h)。六個(gè)轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)

4、據(jù)經(jīng)過過濾后各得到4G左右的clean data，Q30％均大于91％。采用Trinity軟件對(duì)clean data進(jìn)行從頭組裝，得到316，787個(gè)轉(zhuǎn)錄本以及112，033功能基因，其中有63，210個(gè)功能基因可被注釋。將clean data與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，各樣品測(cè)序數(shù)據(jù)與所選參考基因組的序列比對(duì)效率從79.68％到83.01％不等。
　　(2)白粉菌誘導(dǎo)的差異表達(dá)基因
　　以基因表達(dá)水平差異超過2倍、檢驗(yàn)

5、P-value值＜0.005且FDR（錯(cuò)誤發(fā)生率）≤0.01作為差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選的標(biāo)準(zhǔn)。無參考基因組時(shí)在16h處理下，L031與chancellor共有2，932個(gè)基因存在表達(dá)差異，F(xiàn)1和Chancellor存在1，419個(gè)差異表達(dá)基因;在96h處理時(shí)，L031與Chancellor共有4，697個(gè)差異表達(dá)基因，F(xiàn)1和Chancellor存在4，583個(gè)差異表達(dá)基

6、因，后期有更多下游基因表達(dá)被引發(fā);有參考基因組時(shí)，在16h處理下，T1比T3共有5，052個(gè)基因存在表達(dá)差異，F(xiàn)1和Chancellor存在1，832個(gè)差異表達(dá)基因;在96h處理時(shí)，L031與chancellor共有4，710個(gè)差異表達(dá)基因，F(xiàn)1和Chancellor存在4，507個(gè)差異表達(dá)基因。F1與Chancellor的差異表達(dá)基因數(shù)目小于L031與Chancellor的差異表達(dá)基因，說明在試驗(yàn)設(shè)計(jì)中添加F1可減少假陽性差異表達(dá)基因

7、數(shù)目，更加準(zhǔn)確識(shí)別抗性反應(yīng)中的重要基因。結(jié)果顯示侵染后期有更多的下游基因被激發(fā)，證實(shí)了早期侵染是研究小麥在病菌侵染后對(duì)生理小種特異的抗性基因表達(dá)與響應(yīng)的關(guān)鍵時(shí)期。本研究對(duì)比了在16h和96h侵染條件下L031、F1、Chancellor的共調(diào)控基因，在無參和有參兩種條件下均發(fā)現(xiàn)T1比T3與T2比T3共有的重疊基因主要參與翻譯，轉(zhuǎn)錄，復(fù)制，信號(hào)傳導(dǎo)等過程;T4比T6與T5比T6共有的重疊基因，與翻譯，轉(zhuǎn)錄后修飾，能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化，氨基酸代謝

8、等過程有關(guān)，這些重疊的DEGs可能是抗病防御機(jī)制中必不可少的基因。
　　(3)不同侵染時(shí)間基因表達(dá)差異
　　在不同處理時(shí)間三種基因型內(nèi)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，無參考基因組時(shí)T1與T4有2，699個(gè)差異表達(dá)基因，T2與T5有1，952個(gè)差異表達(dá)基因，T3與T6有4，697個(gè)差異表達(dá)基因。96h處理下與植物次生代謝通路有關(guān)的基因富集。有參考基因組時(shí)T1與T4有1，958個(gè)差異表達(dá)基因，T2與T5有3，456個(gè)差異表達(dá)基因，T3與T6有1，49

9、9個(gè)差異表達(dá)基因。差異表達(dá)基因的KEGG富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多通路是侵染后期特有的，包括一些次生代謝途徑，如生物堿合成，類固醇生物合成，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子等。
　　(4)涉及抗白粉病反應(yīng)的抗病基因
　　選取兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)在感病材料中表達(dá)水平為0或接近與0，而抗病材料L031以及F1表達(dá)量極高的差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，許多差異表達(dá)基因是抗性相關(guān)基因。本研究中設(shè)置無參考基因組時(shí)，共發(fā)現(xiàn)8個(gè)編碼LRR家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的功能基因在抗病材料

10、中均表達(dá)上調(diào)，其中5個(gè)功能基因在感病材料中表達(dá)極低，這5個(gè)基因可能參與基因介導(dǎo)的抗性，與識(shí)別侵染激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。另外，47個(gè)重疊基因在兩個(gè)處理的抗感病材料差異表達(dá)基因中發(fā)現(xiàn)，主要編碼抗病蛋白R(shí)GA，RPM以及RPP，受體類似物蛋白激酶，以及一些假設(shè)蛋白。在與參考基因組比對(duì)后，共得到76個(gè)具有相同表達(dá)模式的共調(diào)控新基因，注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有19個(gè)共調(diào)控抗病相關(guān)新基因，基因功能主要涉及抗病蛋白R(shí)PP、RGA、RPM，LRR受體類似絲