HPV經(jīng)Wnt通路致宮頸癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、目的:本實(shí)驗(yàn)通過分別構(gòu)建針對HPV16E6、E7和HPV18E6、E7的microRNA(miRNA)干擾載體并轉(zhuǎn)染HPV16陽性的宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HPV18陽性的HeLa細(xì)胞，抑制癌基因E6、E7的表達(dá)，觀察E6、E7基因沉默對上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)的相關(guān)基因——β-catenin、E-cadherin和N-cadherin和Wnt/β-catenin信號通路表

2、達(dá)的影響，分析HPV與宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT的相關(guān)性，闡明HPV導(dǎo)致宮頸細(xì)胞發(fā)生EMT的可能信號通路機(jī)制，為以HPV為靶點(diǎn)的宮頸癌的基因治療提供系統(tǒng)的理論依據(jù)。
　　 方法:1.培養(yǎng)HPV16陽性的人宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HPV18陽性的人宮頸癌細(xì)胞株HeLa。
　　 2.miRNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及質(zhì)粒提取:分別構(gòu)建針對HPV16E6、HPV16E7、HPV18E6、HPV18E7的miRNA干擾質(zhì)粒，以及1個(gè)陰性對照mi

3、croRNA干擾質(zhì)粒。分別中提各質(zhì)粒以用于瞬時(shí)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過程。
　　 3.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的測定:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)分別轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后通過倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。
　　 4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染:構(gòu)建的干擾載體含對殺稻瘟菌素的抗性，故分別用不同濃度的殺稻瘟菌素作用于宮頸癌細(xì)胞SiHa和HeLa，確定宮頸癌細(xì)胞SiHa和HeLa的篩選濃度及維持濃度;進(jìn)而建立相應(yīng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

4、的細(xì)胞。
　　 5.實(shí)時(shí)定量PCR(Real-TimePCR)技術(shù)檢測各組靶基因的干擾效率:分別以SiHa和HeLa細(xì)胞為陰性對照，檢測各干擾質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞后對各自靶基因HPV16E6和E7、HPV18E6和E7mRNA表達(dá)的影響，計(jì)算各自的干擾效率，篩選出干擾效率最高的質(zhì)粒用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 6.EMT相關(guān)基因的檢測:為進(jìn)一步研究HPV與宮頸癌EMT的相關(guān)機(jī)制，利用Real-TimePCR技術(shù)，檢測

5、HPV被干擾前后Wnt1、β-catenin、E-cadherin及N-cadherin的表達(dá)情況，分別以未轉(zhuǎn)染的SiHa和HeLa細(xì)胞為陰性對照。
　　 結(jié)果:1.倒置相差顯微鏡觀察人宮頸癌細(xì)胞株SiHa和HeLa均生長旺盛，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)多樣化。
　　 2.倒置熒光顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)用各干擾質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后熒光陽性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70-80％。
　　 3.干擾效率的檢測:針對

6、SiHa細(xì)胞系，以未轉(zhuǎn)染的SiHa細(xì)胞為陰性對照，各組分別以各自的GAPDH為內(nèi)參照，Real-TimePCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒HPV16E6-miRNA后，HPV16E6mRNA的表達(dá)量較SiHa細(xì)胞組降低，對HPV16E6的干擾效率達(dá)77.8％，而經(jīng)HPV16E7-miRNA2、HPV16E7-miRNA4轉(zhuǎn)染后HPV16E7rnRNA的表達(dá)量較SiHa細(xì)胞組降低，對HPV16E7的干擾效率分別為67.3％和59.4％，可見H

7、PV16E7-miRNA2具有更高的干擾效率。而轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒(Neg-miRNA)組與SiHa細(xì)胞相比，HPV16E6和E7mRNA的表達(dá)均無明顯變化(P＞0.05)，說明陰性對照質(zhì)粒不影響SiHa細(xì)胞HPV16E6和E7mRNA的表達(dá)。
　　 針對HeLa細(xì)胞系，以未轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞為陰性對照，以GAPDH為內(nèi)參照，Real-TimePCR檢測示轉(zhuǎn)染HPV18E6-miRNA后，HPV18E6mRNA的表達(dá)量較HeLa細(xì)

8、胞組降低，對HPV18E6mRNA的干擾效率達(dá)87.3％，而經(jīng)HPV18E7-miRNA1、HPV18E7-miRNA4轉(zhuǎn)染后HPV18E7mRNA的表達(dá)量較HeLa細(xì)胞組降低，對HPV18E7的干擾效率分別為68％和45.5％，可見HPV18E7-miRNA1具有更高的干擾效率。而轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒(Neg-miRNA)組與HeLa細(xì)胞相比，HPV18E6和E7mRNA的表達(dá)均無明顯變化(P＞0.05），說明陰性對照質(zhì)粒不影響HeLa細(xì)

9、胞HPV16E6和E7mRNA的表達(dá)。說明HPV18E6-miRNA和HPV18E7-miRNA1能高效的轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞株HeLa，并分別使靶基因HPV18E6和E7在mRNA水平上受到了抑制。
　　 故可用質(zhì)粒HPV16E6-miRNA、HPV16E7-miRNA2、HPV18E6-miRNA、HPV18E7-miRNA1、Neg-miRNA作為后續(xù)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的質(zhì)粒。
　　 4.SiHa和HeLa細(xì)胞篩選濃度和維持

10、濃度的確定:經(jīng)含不同濃度的殺稻瘟菌素的培養(yǎng)基培養(yǎng)10天的SiHa和HeLa細(xì)胞，均在殺稻瘟菌素濃度≥9ug/ml時(shí)全部死亡，故確定用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的篩選濃度為10ug/ml，維持濃度為5ug/ml。
　　 5.EMT相關(guān)基因的表達(dá)檢測:①E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)情況:Real-TimePCR結(jié)果示SiHa和HeLa細(xì)胞中E-cadherin均低表達(dá)，而N-cadherin均高表達(dá)。敲除HPVE6、E7基因后的

11、SiHa和HeLa細(xì)胞E-cadherin表達(dá)均明顯升高，N-cadherin的表達(dá)均明顯降低，P均＜0.05。同樣，較未轉(zhuǎn)染組陰性對照質(zhì)粒組無明顯變化，提示干擾HPVE6、E7基因的表達(dá)可使E-cadherin的表達(dá)上調(diào)、N-cadherin的表達(dá)下調(diào)，因而HPVE6、E7與宮頸癌發(fā)生EMT相關(guān)。②Wnt1和β-catenin的表達(dá)情況:以未轉(zhuǎn)染的SiHa和HeLa細(xì)胞為陰性對照，以管家基因GAPDH為內(nèi)參，利用Real-TimePC

12、R技術(shù)檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Wnt1和β-catenin的表達(dá)變化。SiHa細(xì)胞經(jīng)HPV16E6-MiRNA、HPV16E7-MiRNA2轉(zhuǎn)染后較未轉(zhuǎn)染組Wnt1和β-catenin表達(dá)均明顯降低(P均＜0.05）。同樣，在HeLa細(xì)胞中經(jīng)HPV18E6-MiRNA、HPV18E7-MiRNA1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的Wnt1和β-catenin的表達(dá)發(fā)生同樣變化，而陰性對照質(zhì)粒則無明顯變化，提示干擾HPVE6、E7基因的表達(dá)可抑制Wnt1和β-cat

13、enin的表達(dá)，因而在宮頸癌中HPVE6、E7可激活EMT的信號通路之一——經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。
　　 結(jié)論:1.成功構(gòu)建了針對HPVE6、E7的miRNA干擾載體，同時(shí)篩選出了有效的干擾質(zhì)粒，可以直接干擾細(xì)胞內(nèi)目的基因的表達(dá)，而陰性對照質(zhì)粒則不引起相應(yīng)變化，對細(xì)胞內(nèi)原有基因的表達(dá)無明顯作用;同時(shí)篩選出了相應(yīng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究HPVE6、E7對宮頸癌的影響提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。2.H