惡性膠南瘤組織MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及蛋白表達(dá)與患者臨床預(yù)后的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　 惡性膠質(zhì)瘤（WHO分級(jí)Ⅲ級(jí)、Ⅳ級(jí)）是臨床常見(jiàn)的神經(jīng)外科疾病，在中青年死亡原因中排名前列，因其治療的復(fù)雜性，低生存率以及近年來(lái)逐漸增高的發(fā)病率，已成為神經(jīng)外科領(lǐng)域現(xiàn)階段研究的熱點(diǎn)。惡性膠質(zhì)瘤存在廣泛浸潤(rùn)、顱內(nèi)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，即使在手術(shù)中顯微鏡下全切腫瘤，術(shù)后短時(shí)期內(nèi)仍有極高的復(fù)發(fā)率。因此術(shù)后放、化療等綜合輔助治療在膠質(zhì)瘤的治療中具有很大的意義，對(duì)于改善患者生存質(zhì)量，提高生存時(shí)間有很高的價(jià)值。而由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在血腦

2、屏障等原因，惡性膠質(zhì)瘤的化療方案相對(duì)于全身其他系統(tǒng)惡性腫瘤的化療不盡相同，大部分以烷化劑為化療的基礎(chǔ)。
　　 06-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA-methyltransferaseMGMT)是哺乳動(dòng)物機(jī)體中都存在的一種DNA烷基化損傷修復(fù)酶，它同時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)移酶與甲基接受體的作用，將烷化基團(tuán)從06-MG（06-甲基鳥(niǎo)嘌呤）的六位氧轉(zhuǎn)到自身的半膚氨酸殘基上，使DNA鏈上的鳥(niǎo)嘌呤損傷修復(fù)，阻止

3、DNA交聯(lián)形成。因此MGMT可抵消烷化劑對(duì)腫瘤細(xì)胞造成的DNA烷基化毒性作用，因此在腫瘤化療的眾多耐藥因素中，起到重要作用。
　　 在膠質(zhì)瘤烷化劑化療中，MGMT活性被視為提示患者預(yù)后的一個(gè)極其重要的分子指標(biāo)，在研究者間具有廣泛的共識(shí)，MGMT活性高，則烷化劑化療耐藥性強(qiáng)，患者生存期預(yù)后差。反之則預(yù)示好的預(yù)后。
　　 MGMT活性可通過(guò)MGMT的DNA、RNA、蛋白等各個(gè)層面的各種檢測(cè)方法進(jìn)行研究。因RNA提純難度高，降

4、解快等特點(diǎn)，在RNA層面進(jìn)行的MGMT研究較少，難以形成綜合分析。
　　 免疫組化法檢測(cè)的MGMT蛋白表達(dá)在過(guò)去被一致認(rèn)為是烷化劑耐藥、患者生存期預(yù)后的高度可信分子預(yù)測(cè)指標(biāo)，但是在近年來(lái)受到大量分析研究結(jié)果的挑戰(zhàn)，認(rèn)為IHC法檢測(cè)的MGMT蛋白表達(dá)與同組標(biāo)本組織啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)以及患者預(yù)后一致性差，尤其是其中一些META分析和多中心大樣本研究對(duì)MGMT蛋白表達(dá)作為預(yù)后指標(biāo)的質(zhì)疑有一定的說(shuō)服力。
　　 近些年來(lái)的研究證實(shí)腫

5、瘤的發(fā)生與表觀遺傳學(xué)的改變有關(guān)。表觀遺傳學(xué)研究非基因序列改變所致的可遺傳的基因表達(dá)水平的變化，基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島局部甲基化水平異常升高是屬于表觀遺傳學(xué)改變的一種，可導(dǎo)致相關(guān)基因不表達(dá)，蛋白水平下降。使得腫瘤細(xì)胞耐藥性降低，患者獲得更好的預(yù)后。MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)作為烷化劑耐藥、患者生存期預(yù)后指標(biāo)，在近幾年得到了廣泛的認(rèn)可。
　　 以往甲基化特異性的PCR(MSP)法作為大多數(shù)研究中檢測(cè)啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)的首選方法，目前由

6、于不能做定量分析等缺陷，該方法受到各種質(zhì)疑，新研究的啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)方法中，可行甲基化狀態(tài)的定量、半定量分析，各有優(yōu)缺點(diǎn)。其中甲基化特異性-多重連接依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)(Methylation-specificmultiplexligation-dependentprobeamplification，MS-MLPA)由MLPA技術(shù)發(fā)展而來(lái)，是一種將探針雜交與PCR擴(kuò)增相結(jié)合的基因甲基化檢測(cè)技術(shù)。相比經(jīng)典的MSP法，MS-MLPA法有明顯的

7、優(yōu)勢(shì):所需檢測(cè)樣本量小;可省略亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化步驟;同一引物對(duì)擴(kuò)增所有探針增加了可靠性;可得到半定量的甲基化結(jié)果?？捎糜贔FPE等局部降解的DNA;分辨率高，可以同時(shí)獲得基因拷貝數(shù)信息等。是一種值得信賴的檢驗(yàn)方法。
　　 本研究選用的MS-MLPAME011-B1MMR試劑盒檢測(cè)MGMT甲基化狀態(tài)，大致實(shí)驗(yàn)步驟為:首先變性反應(yīng)使靶序列成為為單鏈。隨后雜交反應(yīng)中，長(zhǎng)、短探針中的雜交序列與單鏈靶序列雜交互補(bǔ)。MS-MLPA在雜交反應(yīng)后

8、分兩部分進(jìn)行。一半同常規(guī)MLPA的后續(xù)連接、擴(kuò)增、電泳反應(yīng)，提供拷貝數(shù)信息。另一半反應(yīng)要在MLPA的連接反應(yīng)步驟中同時(shí)加入甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶Hha1處理，以提供甲基化狀態(tài)信息。在連接反應(yīng)中同時(shí)加入Hha1內(nèi)切酶，若靶序列的GCGC位點(diǎn)非甲基化，探針被連接的同時(shí)將被Hha1消化，不能在后續(xù)的PCR反應(yīng)中被擴(kuò)增;若GCGC位點(diǎn)是甲基化的，探針不會(huì)被Hha1消化，連接后的完整探針通過(guò)通用引物由PCR反應(yīng)擴(kuò)增，最終通過(guò)電泳分離，產(chǎn)生電泳峰

9、值信號(hào)。信號(hào)數(shù)據(jù)經(jīng)一系列校正和評(píng)估后，用計(jì)算機(jī)軟件來(lái)計(jì)算，得出該序列的甲基化系數(shù)。
　　 目的：
　　 研究MGMT基因啟動(dòng)子過(guò)甲基化狀態(tài)、MGMT基因拷貝數(shù)、MGMT蛋白表達(dá)與患者生存預(yù)后關(guān)系以及與患者年齡、性別、病理分級(jí)等臨床特點(diǎn)的關(guān)系，探討MS-MLPA法檢測(cè)基因甲基化狀態(tài)的優(yōu)勢(shì)和不足，研究IHC法檢測(cè)蛋白表達(dá)存在的各種問(wèn)題，為MGMT活性高的膠質(zhì)瘤術(shù)后綜合治療作出參考。
　　 研究方法：
　　 實(shí)

10、驗(yàn)標(biāo)本:所有腦膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院病理科，所有非腫瘤性對(duì)照標(biāo)本取自南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)。
　　 觀察對(duì)象:選擇自2006至2010年間在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科治療、術(shù)后病理證實(shí)為腦惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤（按WHOⅢ級(jí)、Ⅳ級(jí)）患者39例，其中男性24例，女性15例，年齡20-68歲，平均46.9歲，病理分級(jí)WHOⅢ級(jí)19人，WHOⅣ級(jí)20人。所有患者均于術(shù)后放療加TMZ（替莫唑胺）化療。同時(shí)選用6例非腫

11、瘤性腦組織標(biāo)本做為對(duì)照組。
　　 觀察方法:追蹤病人的總生存時(shí)間(OS)。以免疫組化法檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織MGMT蛋白表達(dá)，以MS-MLPA法檢測(cè)MGMT基因啟動(dòng)子甲基化以及基因拷貝數(shù)狀態(tài)。將患者按MGMT蛋白表達(dá)情況、MGMT基因啟動(dòng)子甲基化以及基因拷貝數(shù)狀態(tài)分組，評(píng)價(jià)三者與患者生存期的關(guān)系。并觀察MGMT蛋白表達(dá)以及MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與患者年齡、性別、病理分級(jí)之間的關(guān)系。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)

12、計(jì)軟件分析。探討MGMT蛋白表達(dá)、甲基化狀態(tài)、拷貝數(shù)與生存期的關(guān)系用Kaplan—Meier法，生存時(shí)間表示為均數(shù)(±)標(biāo)準(zhǔn)誤。整體比較采用Log—Rank檢驗(yàn)并繪制生存曲線圖，若整體比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異則進(jìn)一步進(jìn)行組間多重比較。分析MGMT蛋白表達(dá)情況與MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)之間相關(guān)性采用Spearman相關(guān)系數(shù);MGMT蛋白表達(dá)情況以及MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)分別與患者年齡、性別、病理分級(jí)之間的關(guān)系用x2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。當(dāng)P＜0.

13、05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)步驟:對(duì)膠質(zhì)瘤石蠟標(biāo)本行免疫組化染色，DAB法顯色。陽(yáng)性對(duì)照為已知的MGMT陽(yáng)性的膠質(zhì)瘤組織。PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷:MGMT陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿，呈棕黃色。按MGMT表達(dá)情況分成三級(jí):無(wú)任何MGMT陽(yáng)性表達(dá)者及MGMT陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10％為陰性（一）;陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)10％-30％為弱陽(yáng)性(+);＞30％陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為強(qiáng)陽(yáng)性(++)。以MS-MLPA法檢測(cè)石蠟標(biāo)本MGMT基因啟

14、動(dòng)子甲基化，選擇6份非腫瘤性人腦石蠟包埋組織作為參考樣本，并設(shè)置一個(gè)以蒸餾水代替樣本DNA的無(wú)DNA陰性對(duì)照反應(yīng)。首先用凱杰QIAAMPDNAFFPETISSUE試劑盒提取石蠟包埋組織的基因組DNA并檢測(cè)濃度(50ng/ul)。按照DNA變性、雜交、連接、PCR擴(kuò)增和電泳分離檢測(cè)的順序行MS-MLPA檢測(cè)，電泳數(shù)據(jù)經(jīng)相應(yīng)的軟件分析，計(jì)算出的拷貝數(shù)系數(shù)和甲基化率。結(jié)果判斷:拷貝數(shù)系數(shù)0.8-1.2者為正常，MGMT拷貝數(shù)系數(shù)＜0.8者視為

15、拷貝數(shù)缺失;拷貝數(shù)系數(shù)＞1.2者視為拷貝數(shù)增多。MGMT探針甲基化比率＜0.25，即樣本未甲基化;0.25＜甲基化率＜0.5，即樣本低度過(guò)甲基化;0.5＜甲基化率＜0.75，即樣本中度過(guò)甲基化。甲基化率＞0.75，即樣本高度過(guò)甲基化。
　　 結(jié)果:
　　 1、蛋白表達(dá)與患者OS（總生存期）關(guān)系:(1)若將標(biāo)本分為MGMT—、MGMT+、MGMT++三組蛋白表達(dá)，觀察與患者總生存期的關(guān)系，MGMT—組與MGMT++組生存時(shí)

16、間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)，其他組間生存時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)若將標(biāo)本分為MGMT—、MGMT+/++兩組蛋白表達(dá)觀察，組間生存時(shí)間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.003)。
　　 2基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與患者OS關(guān)系:未甲基化、低度過(guò)甲基化、中度過(guò)甲基化、高度過(guò)甲基化四組生存時(shí)間均存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)?？截悢?shù)狀態(tài)與患者OS關(guān)系:拷貝數(shù)缺失、拷貝數(shù)正常、拷貝數(shù)增多3組間生存時(shí)間整體比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.93

17、8)。
　　 3、男女兩組組患者之間、≥50歲和＜50歲兩組患者之間、WHOⅢ級(jí)和Ⅳ兩組患者之間的MGMT蛋白表達(dá)差異都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。男女兩組組患者之間、≥50歲和＜50歲兩組患者之間、WHOⅢ級(jí)和Ⅳ兩組患者之間的甲基化狀態(tài)差異也都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 4、惡性膠質(zhì)瘤組織MGMT蛋白表達(dá)與MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，Spearman秩相關(guān)系數(shù)為0.697(P＜0.001)。
　　 結(jié)論:

18、r>　　 1、MS-MLPA法檢測(cè)MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)是一種可靠的方法。相比經(jīng)典的MSP法，MS-MLPA法具有優(yōu)勢(shì)。
　　 2、惡性膠質(zhì)瘤組織MGMT基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與患者生存期存在顯著相關(guān)性，甲基化率越高者預(yù)后越好。與患者年齡、性別、病理分級(jí)無(wú)相關(guān)性。惡性膠質(zhì)瘤組織基因拷貝數(shù)狀態(tài)與患者生存預(yù)后無(wú)相關(guān)性。
　　 3、惡性膠質(zhì)瘤組織MGMT表達(dá)與患者生存預(yù)后存在相關(guān)性，表達(dá)陽(yáng)性者比表達(dá)陰性者生存率更低。IH