GRGDSPC多肽表面修飾PET人工韌帶促進腱骨愈合的實驗研究.pdf

1、[背景]
　　 對于重建膝關節(jié)交叉韌帶損傷的材料有多種，但各自均有優(yōu)缺點。聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韌帶具有力學性能良好，取材方便，手術簡單，術后康復快等優(yōu)點，是一種具有良好應用前景的移植材料。但PET人工韌帶在骨隧道內能否達到“腱骨愈合”可能影響交叉韌帶重建的遠期療效。雖然文獻報道應用LARS人工韌帶重建術后的近期療效良好，但遠期療效尚不明確。LARS人工韌帶為PET惰性材料，PET材料與骨界面是否能最終達到生物性愈合

2、，對于應用PET人工韌帶重建交叉韌帶術后的遠期療效具有重要意義。本研究通過應用多肽表面修飾PET材料，促進PET材料與細胞的組織相容性，進一步觀察其在體內與骨界面的生物性愈合情況，初步探討PET人工韌帶與骨界面實現(xiàn)生物性愈合的可行性。
　　 [目的]
　　 1.通過回顧性分析應用LARS人工韌帶重建前交叉韌帶術后患者的骨隧道變化特點及可能的影響因素，初步探討人工韌帶與骨界面的結合情況，為下一步研究人工韌帶“腱骨愈合”打下

3、基礎。2.應用GRGDSPC多肽表面修飾PET材料，初步探討實現(xiàn)PET材料與GRGDSPC多肽實現(xiàn)高效共價結合的簡單易行的操作方法。3.將表面修飾后的PET材料與骨髓間充值干細胞體外共培養(yǎng)，探討GRGDSPC表面修飾PET材料后促進其生物相容性的有效性。4.將GRGDSPC表面修飾后的PET材料植入體內，初步觀察PET材料與骨界面的生物性愈合情況，為將來實現(xiàn)臨床應用提供依據(jù)。
　　 [方法]
　　 1.2004年8月至2

4、007年4月對43例應用LARS人工韌帶重建ACL患者（其中男31例，女12例;左膝19例，右膝24例;平均年齡為27.5歲）進行3年的隨訪，于術后1、3、6、12、24、36個月分別進行X線和CT檢查，記錄各個時間段脛骨和股骨骨道的寬度。以Lysholm評分測定膝關節(jié)功能，以KT-1000測量膝關節(jié)的松弛度。
　　 2.分別應用NaOH堿性水解方法處理PET材料及應用H2SO4和KMnO4處理PET材料。將處理后的PET材料及

5、未經(jīng)處理的PET材料分別與不同溶度的GRGDSPC多肽溶液進行結合，采用傅里葉變紅外光譜分析及X線衍射分析技術，分析其共價結合效果和多肽結合含量。
　　 3.分別將表面修飾的PET材料和未經(jīng)處理的PET材料與骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)，掃描電鏡下分別觀察細胞的粘附和增殖情況，細胞血球板計數(shù)法測定細胞的粘附率。同時應用細胞茜素紅染色法及堿性磷酸酶法鑒定骨髓間充質干細胞的成骨誘導分化。
　　 4.選用新西蘭兔建立前交叉韌帶損傷動

6、物模型，分別將表面修飾的PET材料和未經(jīng)處理的PET材料植入動物體內，在不同時間節(jié)點上采用HE染色法和掃描電鏡觀察PET材料與骨界面的結合情況。
　　 [結果]
　　 1.隨訪時間為36～49個月，平均39.5個月。按照Peyrache等提出的分級方法(0級＜2mm，1級2～4 mm，2級4～6 mm，3級≥6mm)，僅3例出現(xiàn)了骨道1級擴大，均為術后6個月發(fā)生在股骨隧道，未發(fā)現(xiàn)2級和3級骨道擴大，3例骨道擴大部分均位于

7、股骨隧道近關節(jié)面水平，平均擴大(2.5±0.3) mm。40例0級擴大患者至末次隨訪時，脛骨骨道平均增寬為(0.8±0.3) mm，股骨骨道平均增寬為(1.1±0.3) mm。不同時間段骨道寬度的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。X線與CT測量結果基本一致。末次隨訪時，3例骨道1級擴大病例Lysholm評分平均為(94.5±4.6)分，KT-1000前移差值平均為(1.5±1.1)mm;40例0級擴大病例Lysholm評分平均為(95.

8、6±4.8)分，KT-1000前移差值平均為(1.4±1.5) mm。
　　 2.采用NaOH堿性水解方法處理PET材料方法簡便可靠，效率較高。應用H2SO4和KMnO4處理PET材料及單純將PET材料與GRGDSPC多肽混合，并無法實現(xiàn)與GRGDSPC多肽共價結合。堿性水解法處理的PET材料與GRGDSPC多肽的結合效果最佳。FTIR提示7.5mg/ml的GRGDSPC多肽濃度與材料共價結合的效率較好，增加GRGDSPC多肽濃

9、度后，其共價結合效率提高并不明顯。XPS提示:7.5mg/ml的GRGDSPC多肽表面修飾的PET材料氮元素含量達2.43％，而未經(jīng)處理的PET材料分別與7.5mg/ml，12 mg/ml和3 mg/ml的GRGDSPC多肽混合后的氮元素含量分別為1.99％，1.96％，1.42％。
　　 3.新西蘭兔骨髓間充質干細胞實現(xiàn)成功的分離、傳代培養(yǎng)、冷凍保存、復蘇及誘導分化為成骨細胞。骨髓間充質干細胞與PET材料共培養(yǎng)后實現(xiàn)了早期粘附

10、和增殖，隨著時間的增長，各組材料的細胞粘附率均提高，培養(yǎng)48小時后，GRGDSPC多肽表面修飾的PET材料對細胞的粘附率顯著增高，其次為GRGDSPC多肽混合PET材料組，最次為未處理PET材料組。
　　 4.新西蘭兔膝關節(jié)交叉韌帶損傷模型建立后，將各種處理條件的PET材料植入體內。隨著造模時間的延長，應用GRGDSPC多肽表面修飾的PET組效果最好，PET材料與組織結合緊密，且結合量很多。其次為GRGDSPC多肽混合PET材料

11、組，PET材料與組織結合部分緊密，材料空隙間結合量少;最次為未處理PET材料組，僅少量PET與組織結合。HE染色提示表面修飾后的PET材料表面有大量的成纖維細胞粘附增殖，而未處理PET材料材料表面僅有少量的細胞粘附生長。
　　 [結論]
　　 LARS人工韌帶重建前交叉韌帶術后，骨道擴大并不明顯，這種變化特點間接提示了人工韌帶在骨道內并沒有經(jīng)歷類似自體移植物那樣的組織壞死及對骨道壁的再塑形過程，雖然人工韌帶與骨道的結合情

12、況尚不清楚，但進一步研究促進人工韌帶與骨界面的生物性愈合具有重要意義。應用NaOH堿性水解方法處理PET材料方法簡便可靠，效率較高，堿性水解法處理后的PET材料與GRGDSPC多肽實現(xiàn)了共價結合，GRGDSPC多肽表面修飾的PET材料可明顯提高材料與細胞的粘附和增殖，體內試驗證明表面修飾后的PET材料與組織結合更緊密，成纖維細胞的含量更多。但PET人工韌帶與骨界面的結合情況仍需延長動物體內實驗時間，以進一步觀察其是否最終實現(xiàn)生物性結合。