APP菌毛亞單位apfA基因克隆、原核表達及免疫原性研究.pdf

1、根據GenBank報道的豬傳染性胸膜肺炎血清1型的APPapfA基因序列(NCBI登陸號：AY235718)設計并合成引物，以細菌DNA提取試劑盒提取SC-A株的總DNA為模版，用PCR方法擴增出長度為497bp的目的基因片段。將該基因克隆pMD18-T載體上，經序列測定，結果表明獲得了豬傳染性胸膜肺炎血清1型的SC-A株的克隆。該基因包含豬傳染性胸膜肺炎血清1型的SC-A株apfA基因的全長為447個堿基的開放閱讀框，編碼149個氨基

2、酸組成的功能蛋白。序列分析表明：該基因與GenBank上收錄的豬傳染性胸膜肺炎血清3型、4型和7型在編碼的氨基酸上同源性較高，均為99.3％。 將豬傳染性胸膜肺炎血清1型的SC-A株apfA基因的信號肽去除后，應用PCR技術擴增出編碼apfA成熟蛋白的基因，并將該成熟蛋白基因重組到原核表達載體pET-32a(+)。經酶切、PCR鑒定，表明所構建的重組質粒為APP的apfA基因原核表達質粒。將重組質粒轉入表達菌BL21star(D

3、E3)細胞，陽性菌落篩選、SDS-PAGE分析以及Westernblot分析表明，成功構建了APP的apfA的大腸桿菌基因工程菌株。用IPTG作為誘導劑對基因工程菌株進行誘導。結果顯示，在分子量約為32kDa處有明顯得蛋白質表達條帶，與預期的融合APPapfA成熟蛋白大小一致。表達的蛋白質主要以不溶性包涵體形式存在，約占菌體總蛋白的42.5％。重組成熟蛋白純化復性后，免疫小白鼠，經ELISA檢測發(fā)現，隨免疫次數的增加抗體滴度逐漸升高；經